嗜热脱氮芽孢杆菌α-半乳糖苷酶的分子改造以及突变体酶学性质研究

α-Galactosidase, also called melibiase, is an exoglycosidase that hydrolyze α-1,6-galactosidic linkages of various galacto-oligosaccharides and polymeric galatomannans from the non-reducing end，such as melibiose, raffinose, stachyose, glycosphingolipids and glycoproteins which are widely distributed in nature. α-Gals has been widely used in scientific research, medical, food, and industrial, and it is considered to have a very large potential application. However, in industrial applications, most of the industrial production usually involves high-temperature processing which is easy to make a sharp decline in the activity of the enzyme or even inactive. So improveing the thermal stability of α-Gals will have a very important significance in high-temperature industry. In this study, based on the known characterization of thermophilic α-Gals YWX5, We aim to achieve site-directed mutagenesis for protein using bioinformation analysis and genetic engineering techniques, studying the changing in the enzymatic properties of mutants through experimental verification and hope to obtaining mutants with high thermal stability. Taking the combination of computer simulation and experiments will significantly reduce the workload of the experiment , and the obtained mutants of α- galactosidase can provide more choices for industrial applications.This research will also be able to provide a theoretical basis for clarifying the heat mechanism of thermophilic α- galactosidase.

α-半乳糖苷酶又称密二糖酶，能水解蜜二糖、棉籽糖、水苏糖、糖鞘脂、糖蛋白等含有α-1,6-键结合的末端半乳糖残基类物质，其底物在自然界中分布广泛，因此，α-半乳糖苷酶在工业、食品、医疗和科学研究中有着广泛的应用，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。但在工业应用中，一般会涉及高温工艺，如何有效提高酶的热稳定性，是将α-半乳糖苷酶应用到这些行业所必须解决的问题。本课题在已获得的嗜热α-半乳糖苷酶YWX5，并系统研究了其酶学性质的的基础上，利用计算机辅助蛋白质设计筛选突变位点，然后采用基因工程技术手段对蛋白质进行点突变，并通过实验验证突变蛋白在酶学性质上的变化，以期获得具有更高热稳定性的α-半乳糖苷酶。本课题采取计算机模拟和实验相结合的研究方式，大大节省了实验工作量；所获得的α-半乳糖苷酶突变体可为工业应用提供更多的选择；同时能为阐明嗜热α-半乳糖苷酶的耐高温机制提供理论依据。

嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，克服了常温酶在应用过程中出现的化学性质不稳定现象，使很多高温化学反应得以实现，从而将极大地促进生物技术产业的发展。α-半乳糖苷酶能水解蜜二糖、棉籽糖、水苏糖、糖鞘脂、糖蛋白等含有α-1,6-键结合的末端半乳糖残基类物质，在底物浓度较高时具有转半乳糖基的作用，在饲料、食品、医疗和科学研究中有着广泛的应用，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。.本课题在已获得的嗜热α-半乳糖苷酶的基础上利用计算机辅助蛋白质设计筛选可提高酶稳定性的突变位点，并采用基因工程技术手段对蛋白质进行点突变，通过实验验证突变蛋白在酶学性质上的变化，从而获得具有更高热稳定性的α-半乳糖苷酶。.通过模拟分析各突变体的RMSD、RMSF和Rg值，我们最终确定了Y93S突变体。采用重叠PCR的方法，克隆了突变基因，并与表达载体pGEX-4T-3连接，诱导表达和纯化了重组蛋白。酶学性质研究表明Y93S突变体的最适温度为70℃，较野生型提高了15℃，在90℃下的半衰期由60min提高到120min以上，最适pH及pH稳定性变化不明显。进一步分析Y93S蛋白的耐热机制，结果表明93位Y氨基酸残基RMSD值比突变后的93S氨基酸残基高，这说明突变后的氨基酸残基加强了分子结构的刚性。氢键分析表明突变后的氨基酸残基较无突变的氨基酸残基多引入了一个氢键，并且在分子动力学模拟过程中，93S氨基酸与234A氨基酸所形成的氢键数目多于93Y与234A所形成的氢键。离子对分析表明，突变后的氨基酸残基增强了其附近两个离子对之间的相互作用，使得其在高温环境下依然保持分子结构的稳定而不被破坏。.总体而言，Y93S突变酶的热稳定较野生型有了较大提高，在饲料加工等高温工业领域中有较好的应用潜力。

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