新型碱性α-淀粉酶热稳定性分子改造研究和机理分析

The amino acid residues which locate in protein flexible area are most dramatic dynamic variation for its low interaction with others residues. The protein denaturation most likely occur in the flexible area at high temperature. To investigate the mechanism of thermalstable protein, the study of molecular dynamic simulation in different temperature will be carried out base on the structure from homology modeling of a novel alkaline α-amylase from hot spring. According to the RMSF, the amino acids in flexible area will be selected as mutagenesis candidates. All candidates will be screened by mutagenesis simulation using DS4.1 software. The single or multiple mutation will be conducted on the resulting energy and conformation stable amino acids. Following the enzyme activity and thermal stability assay, the thermal stability improved mutants will be analyzed by differential scanning calorimetry and circular dichroism spectroscopy. The conformation study on the thermal stability improved mutants within the NMR time scale will characterize its dynamics and the improvement of thermal stability as well as verify and adjust the molecular dynamic simulation. The data will provide fundamental knowledge that may contribute to further enhancement of enzyme thermal stability through molecular engineering.

蛋白的柔性区域氨基酸，由于与其他氨基酸残基非共价作用力较弱，是蛋白结构中动态变化最明显的部位。温度升高时，柔性区域往往是蛋白结构中最早解构的区域。对来源于火山温泉的新型碱性α-淀粉酶进行同源建模，对获得的建模结构开展不同温度条件下的分子动力学模拟，根据模拟结果的RMSF值进行柔性区域位点氨基酸的选择。对选取的氨基酸位点进行虚拟突变，选取能量和空间构型稳定的突变子进行单点或多点的突变改造实验。对突变酶开展酶活分析和热稳定性实验检测，选取热稳定性提高的突变酶进行差示扫描量热仪和圆二色谱仪分析，从热力学特征对蛋白耐热机理进行分析。选取热稳定性提高明显的突变酶开展核磁共振分析，通过对不同时间尺度的突变酶构象变化研究，分析突变酶的动力学特征和耐热机理，同时对分子动力学模拟结果进行检验和修正，为生物质能源酶的热稳定性改造从选点到突变提供进一步的理论和实践依据。

通过挖掘或改造以获得高热稳定性的酶，是酶的工业化应用中的重要任务。嗜热菌来源的酶，由于其内在固有的属性，既可以作为热稳定性酶，同时又是酶的热稳定性研究的极好材料。本项目从来源于火山温泉土壤的嗜热菌Anoxybacillus sp.GXS-BL中，克隆表达了耐热碱性α-淀粉酶AGXA。AGXA与目前广泛应用的α-淀粉酶的序列一致性低于30%， 与来源于Anoxibacillus spp.的α-淀粉酶5A2A的序列一致性为97%，具有Štefan Janeček等提出的新的GH13亚家族特征。项目进行了：Ca2+提高AGXA热稳定性、Zn2+抑制AGXA活性AGXA的活性改造和热稳定性改造等研究。(1）Ca2+加入，AGXA的Topt提高10 ℃，T50提高10.5 ℃。Ca2+通过增强AGXA的二级结构稳定性、减少构象偏移值RMSD、增大热去折叠过程中的焓变化值ΔH、降低热容变化值ΔCp来提高AGXA的热稳定性。（2）Zn2+加入，AGXA的CD图谱变化明显，RMSD构象偏移值减少、柔性降低；催化口袋外沿第178号氨基酸残基F178通过C-CA-CB-CG二面角的转换对AGXA的活性口袋起开或关的作用。(3)选取F178进行突变改造，F178A和F178G的催化效率分别比原始酶的提高56.3%和128.9%。MD研究表明，F178A活性口袋体积比原始酶的增大约110 Å3，更有利于底物的进出。（4）根据不同温度MD的残基RMSF值，结合主链弛豫速率和稳态异核NOE值，对AGXA进行热稳定性改造位点选择，虚拟饱和突变进行替换氨基酸的选取，突变实验验证，发现位于该α-淀粉酶A结构域中的第7个β折叠和第7个α-螺旋的连接环区D358残基，突变为I时，突变酶的Topt比原始酶的提高8.6%。DSC分析表明，D358I通过采取降低ΔS和降低ΔCp的方式增大热稳定性。本项目研究，揭示了Ca2+ 提高AGXA的热稳定性机制、Zn2+对AGXA活性的精巧调控机制，为进一步扩大该酶的应用提供了理论和实验依据。研究发现催化口袋外沿的F178氨基酸残基对催化具有“门控作用”；发现D358I提高酶的热稳定性，在B结构域进行的突变降低酶热稳定性和活性，在α-淀粉酶的研究中未见有报道，对其它α-淀粉酶的活性和稳定性改造具指导作用。

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