HIF-1α/EPO信号通路基因突变在高原红细胞增多症中的作用及机制研究

High altitude polycythemia (HAPC) is a series of chronic high altitude diseases due to the increased red blood cell production in response to low oxygen tension at high altitudes. HAPC and other mountain diseases are the major limiting factor for economic development and tourism development in the Qinghai-Tibet Plateau. The epidemiological survey shows that there is Racial/ethnic and gender differences in the incidence of HAPC. In this study, high-throughput sequencing will be applied in cohorts totaling 100 cases and 100 controls to screen common SNP and rare mutations in the functional region of 104 genes in the HIF-1α / EPO signal transduction pathway, with the goal of exploring the mechanism of HIF-1α / EPO signal transduction pathway in HAPC pathology. Common and rare mutations truly associated with HAPC will be further screened out using high-throughput SNP genotyping method SNPscanTM in additional 1000 individuals. The effects of these variants on clinical outcomes will be investigated as well. Mutant expression vectors will be constructed with commercial kit and transfected into PMN cells. For the purpose of evaluating the impact of the mutant on PMN cell function, phagocytosis ability of FITC-labeled E. coli will be determined by flow cytometry and the neutrophil respiratory burst function of PMN detected by dihydropyrido-fluorescein (DCFH-DA) fluorescence probe. The mechanism of common and rare mutations in HAPC pathology will be explored, with the hope of discovering new therapeutic targets for HAPC disease.

高原红细胞增多症（HAPC）是高原低氧环境下红细胞过度增生引起的慢性病，严重影响人民健康和经济发展。不同人群调节红细胞和血红蛋白水平的基因不同。前期研究提示HIF1α、EPO基因与HAPC发生相关，本项目结合基因组学、细胞分子和生物信息学等学科交叉技术，系统的对藏族HAPC病例和健康对照各100例的HIF-1Α/EPO信号通路104个基因的功能区进行深度测序，发掘相关基因突变，研究该通路在HAPC中的作用；用SNPscanTM技术对HAPC病例和对照各500例筛选验证HAPC相关变异；构建突变载体，转染至多形核中性粒细胞(PMN)，流式细胞仪检测PMN对FITC标记细菌的吞噬能力，用双乙酰基二氯荧光素(DCFH-DA)荧光探针法检测PMN呼吸爆发功能，评估突变对PMN生物学功能的影响。解析突变在HAPC发生的作用机制，为HAPC防治提供新的理论依据。

高原红细胞增多症（HAPC）是高原低压低氧环境下红细胞过度增生引起的慢性高原病，发病率高、危害大，严重危害高原人民的身心健康和当地经济发展。本项目结合基因组学、转录组学、细胞分子和生物信息学等学科交叉技术，系统的对藏族HAPC病例和健康对照组遗传差异进行探究。.在基因组层面，对HAPC病例、对照100例样本进行外显子测序，发现在HIF-1α/EPO信号通路9个基因的多个SNP位点与HAPC相关；在氧代谢和红细胞调控相关的基因通路筛选了12个候选基因。进一步扩大研究样本量，在HAPC病例(567例)和对照(360)样本中验证其中6个基因（STAT3、STAT5A、RUNDC3B、PDK1、IL12RB和TCL1A）的变异是否与HAPC相关，最终确定STAT3 基因的SNP rs2293152和 IL12RB1 基因的3个SNPs rs393548、rs436857 和 rs845380与藏族 HAPC 的发生有关，可能参与HAPC 发生过程。.在转录组层面，对HAPC病例39例和对照42例外周血进行转录组测序，对测序结果进行多层次生物信息学分析，发现有550个基因存在显著差异表达，其中有477个差异表达基因（Differentially Expressed Gene，DEG）至少在男性或女性HAPC样本中有差异且在男女间的变化方向一致。GO分析和KEGG通路富集结果显示，上调的基因主要富集在红细胞分化和发育、细胞数量稳态等生物学过程；下调的基因主要富集在免疫球蛋白生成及其介导的免疫应答、补体激活经典途径等。对HAPC的病理表型与DEGs进行了关联分析，发现富集在同一簇的病理表型---红细胞体积分布宽度（RDW-CV和RDW-SD）与DEGs存在较强的相关性，进一步筛选确定数个基因很可能是连接HAPC与此病理表型之间重要的纽带。.使用K562细胞，在1%O2，40μM 氯化血红素刺激24小时，成功构建HAPC细胞模型。提取体外细胞模型的总RNA，从转录水平验证测序筛选的差异表达基因的表达情况。虽然这些基因在HAPC中的作用还需进一步研究，但为研究HAPC的潜在机制提供了新的靶标，以待后续进一步的功能探究。本研究为理解世居高原人群HAPC的发病机制及筛选致病基因提供了重要的数据基础，同时为HAPC防治提供新的理论依据。

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