肺动脉闭锁拷贝数变异及候选基因鉴定研究

Based on the hypothesis that rare structural variants encompassing key genes play an important role in heart development in PA patients, we performed high-resolution genome-wide microarrays for copy number variations (CNVs) in 82 PA patient-parent trios and 189 controls with an Illumina SNP array platform. CNVs were identified in 17/82 patients (20.7%), and eight of these CNVs (9.8%) are considered potentially pathogenic. Five de novo CNVs occurred at two known congenital heart disease (CHD) loci (16p13.1 and 22q11.2). Two de novo CNVs (5q14.1 and 10p13) that may affect folate and vitamin B12 metabolism were identified for the first time. A de novo 1-Mb deletion at 17p13.2 may represent a rare genomic disorder that involves mild intellectual disability and associated facial features.Based on the above results.After reviewing the related literatures we considered DHFR gene as "Candidate Gene" of pulmonary atresia.In the next study,the dhfr knock-in zebrafish will be created by using Crispr/Cas9 system.In the model of dhfr knock-in zebrafish,we'll observe the cardiac development and detect the methylation of nkx2-5,mef2c,tbx20 and tbx1.The results of this study will provide the solid evidence to prove our hypothesis.

利用已收集的肺动脉闭锁患者及其父母样本，研究拷贝数变异在肺动脉闭锁患者中的发生率及在先天性心脏病遗传致病机制中的作用。抽取患者及父母外周血样本，进行染色体G显带分析及常见基因突变检测。提取外周血gDNA，应用SNP array芯片技术检测拷贝数变异。使用荧光定量PCR验证SNP array芯片分析结果。前期工作中我们发现8例患者中检测到已知或可能与疾病相关的染色体微缺失或微重复，其中4例为22q11.2微缺失，1例为16p13.1微重复，1例为5q14.1微重复，1例为10p13微重复，1例为17p13.2微缺失。其中5q14.1微重复区间包含DHFR基因，其与叶酸代谢密切相关。在前述基础上，参考文献考虑DHFR基因为肺动脉闭锁“候选基因”，拟运用斑马鱼模型及Crispr/Cas9技术进行DHFR基因敲入研究。继而观察胚胎发育，尤其是心血管系统发育情况；检测DHFR基因可能影响的组蛋白赖氨酸甲基化修饰水平及NKX2-5，MEF2C，TBX20及TBX1等心脏发育相关转录因子的表达及甲基化水平，针对DHFR基因表达量及甲基化稳态改变对胚胎发育的影响进行初步研究。

项目背景：先天性心脏病是最常见的出生缺陷，其发病机制有待进一步的研究，全基因组微阵列芯片及新一代测序技术在先天性心脏病中的应用表面遗传因素在其发病机制中占据重要作用。前期工作中我们利用SNP-array芯片技术检测肺动脉闭锁患者的拷贝数变异。使用荧光定量PCR验证SNP array芯片分析结果。我们发现8例患者中检测到已知或可能与疾病相关的染色体微缺失或微重复，其中4例为22q11.2微缺失，1例为16p13.1微重复，1例为5q14.1微重复，1例为10p13微重复，1例为17p13.2微缺失。其中5q14.1微重复区间包含DHFR基因，其与叶酸代谢密切相关。17p13.2 微缺失区段包含CAMTA2 基因，在小鼠中其与NKX2.5相互作用，受HDACs调控，与心脏扩大相关。.研究内容：我们利用斑马鱼模型及Crispr/Cas9技术研究dhfr基因及camta2 基因在斑马鱼心脏发育中的作用。目前已成功制备出camta2基因敲除斑马鱼模型及dhfr基因敲入斑马鱼模型。并对camta2基因在斑马鱼心脏发育中的作用进行了初步研究。此外，还运用SNP-array芯片及新一代测序技术对综合征型先天性心脏病患者样本进行检测以期发现可能的“候选基因”。.主要结果：利用camta2基因敲除斑马鱼与Nppa荧光纯合子斑马鱼杂交进一步研究发现camta2基因缺失可能导致斑马鱼心房扩大，但对斑马鱼存活无明显影响。下一步将对与camta2表达及其相关的调控机制研究。dhfr基因敲入斑马鱼模型采用多种方法尝试后目前刚获取dhfr CDS过表达基因斑马鱼，待稳定传代后将对其进一步研究。除上述工作外，我们对综合征型先天性心脏病患儿样本采用SNP-array芯片，全外显子测序及全基因组测序等方法进行遗传变异的研究，国内首次遗传学诊断一例Emanuel综合征患儿；亦发现NKX2.5基因突变与全内脏反位相关。.科学意义：上述结果强调了新的遗传学检测技术对先天性心脏病分子生物学诊断的必要性和重要性，为筛选心脏发育相关“候选基因”奠定基础，并推动对其生物作用及调控机制的研究。

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