Alg13在小鼠后天脑皮质发育过程中的功能研究

Compared with other epilepsy patients, those with malformations of cortical development(MCDs) always show earlier and severer epileptic seizure, along with early drug-resistance. Alg13 is an X-linked gene encoding Alg13 protein which can form the uridine diphosphate-N-acetylglucosaminyltransferase with Alg14 to catalyze N-linked glycosylation. Previous studies have shown that there are Alg13 gene mutation in girls with early-onset severe epilepsy, mental retardation and visual retardation, and in boys with microcephaly, epilepsy and premature death caused by severe congenital disorders of glycosylation (CDG), in which the role and mechanism of Alg13 is still unclear. Accordingly, the hypothesis is proposed that epilepsy induced by Alg13 gene mutation may be related to the occurrence and development of MCD. By studying the Alg13 knockdown animal models applied with morphology, molecular biology, histology and other technologies, the aims of this project are exploring the expression and histological localization of Alg13 in animal models of epilepsy, analyzing the correlation between expression of Alg13 and MCD, and clarifying the role of Alg13 in MCD. To illustrate the above issues will help to further understand the pathological MCD pathogenesis, to provide a theoretical basis for better understanding of the mechanism of epileptiform MCD and provide experimental evidence and new therapeutic targets for controlling refractory epilepsy.

伴有MCD的癫痫病人，其癫痫症状的发作比其他癫痫病人更早、程度更重，且早期出现耐药。Alg13是X连锁基因，编码Alg13蛋白，其与Alg14形成复合体，催化N连接的糖基化。前期研究显示，在早发型严重癫痫、智力障碍、视觉发育迟缓的女性患儿，及在有严重先天性糖基化紊乱造成的小头畸形、癫痫和早夭的男性患儿中均存在Alg13基因突变。Alg13在其中的作用及机制尚不清。据此提出，Alg13基因突变致痫可能与MCD的发生、发展过程相关。本项目拟通过对Alg13敲基因小鼠的研究，综合运用形态学、分子生物学、组织学等技术，探讨Alg13在癫痫动物模型中的表达和组织学定位；分析 Alg13的表达水平与 MCD的相关性；明确Alg13在 MCD中的作用。阐明上述问题，将有助于进一步认识MCD的病理发生，为更好理解MCD的致痫机制提供理论依据，更为控制难治性癫痫发作提供实验依据和新的治疗靶点。

伴有MCD的癫痫病人，其癫痫症状的发作比其他癫痫病人更早、程度更重，耐药出现早。前期研究显示，在早发型严重癫痫、智力障碍、视觉发育迟缓的女性患儿，及在有严重先天性糖基化紊乱造成的小头畸形、癫痫存在Alg13突变。Alg13在其中的作用及机制尚不清。据此提出，Alg13突变致痫可能与MCD发生、发展相关。本项目拟通过对Alg13敲基因小鼠的研究，运用形态学、分子生物学、组织学等技术，探讨Alg13在癫痫动物模型中的表达和组织学定位；分析Alg13的表达与MCD的相关性；明确Alg13在MCD中的作用。为阐明上述问题，本研究主要以Alg13KO小鼠（KO小鼠）模型作为研究基础，先用PCR对KO小鼠进行鉴定，再通过WB，IHC，IF检测ALG13在小鼠大脑表达，结果发现其中枢神经系统中ALG13的表达具有组织学特异性。用KA和匹罗卡品诱导KO小鼠，并用脑电监测癫痫活动和Racine评估癫痫等级，均发现KO小鼠癫痫易感性增加。使用尼氏染色观察癫痫后KO小鼠海马，其海马区反应性星形胶质细胞增生、神经元损伤和苔藓纤维发芽明显。视频脑电显示KO小鼠具有自发性癫痫倾向，地西泮可抑制其癫痫活动。膜片钳技术表明ALG13缺失影响GABAAR介导的mIPSC改变。WB、IF检测KO小鼠Gabra2显著减少。行为学实验表明，无癫痫的成年雌性KO小鼠幼儿期、青春期成年期的行为能力均下降。高尔基染色观察到不同年龄段的雌性KO小鼠树突复杂性和树突棘密度下降。质谱方法分析表明，ALG13基因的缺失可导致其参与的N端修饰蛋白发生糖基化位点修饰异常，尤其是Grin1，影响了cAMP信号通路以及皮层发育。这些结果表明ALG13参与小鼠的神经发育，导致KO小鼠出现认知功能下降、自发性癫痫和癫痫易感性增加，上述发现为临床工作中加强ALG13的筛查提供了科学理论基础，也为重视N端糖基化异常在癫痫中发展提供了理论依据。

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