人工辅酶依赖型1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶创制研究

Isopentenyl pyrophosphate (IPP) is a common intermediate metabolite for terpenoids; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP)-dependent 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) is a key enzyme in the IPP biosynthesis pathway. Over the years, we devoted to creating artificial coenzyme nicotinamide cytosine dinucleotide (NCD)-dependent oxidoreductases, NCD synthetase and NCD self-sufficient Escherichia coli engineering strains. This project intends to create NCD-preferred DXR mutant (Dxr*), and provide new tools for selective regulation of IPP biosynthesis. First, using NCD-associated biological elements, a growth-coupled NCD-dependent oxidoreductase screening platform will be constructed. Second, we will construct DXR mutant-expressing libraries, and screen for the NCD-dependent DXR according to the growth difference. Then we will create NCD-preferred Dxr* with the guidance of crystal structure and kinetics, and reveal the molecular basis of coenzyme preference. Last, we will construct cell factory with NCD-associated biological elements and Dxr* using E. coli as hosts, and test the selective regulation performance of IPP biosynthesis pathway. The achievements of this project have important value for construction of high-efficiency terpenoids cell factory, and will provide new tools, new materials, and new strategies for NCD-related synthetic biology and chemical biology.

异戊烯焦磷酸（IPP）是萜类合成的关键中间体；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）依赖型1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）是IPP合成关键酶。申请人前期参与构建了人工辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）偏好型氧化还原酶、NCD合成酶及NCD自给型大肠杆菌工程菌。本项目拟创制NCD偏好型DXR（Dxr*），为选择性调控IPP合成提供新工具。首先，利用NCD关联的生物学材料，构建生长耦联的NCD依赖型酶筛选平台；其次，构建DXR突变体表达文库，通过生长差异筛选NCD依赖型DXR，结合晶体结构和酶动力学数据，优化创制Dxr*，并揭示辅酶偏好性分子基础；最后，以大肠杆菌为底盘细胞，利用NCD关联的生物学元件和Dxr*构建细胞工厂，测试选择性调控IPP合成的性能。项目成果对构建萜类化合物细胞工厂具有重要参考价值，并将为基于人工辅酶NCD的合成生物学和化学生物学研究提供新工具、新材料和新思路。

异戊烯焦磷酸（IPP）是萜类合成的关键中间体；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）依赖型1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）是IPP合成关键酶。本项目拟利用NCD关联的生物学材料，构建生长耦联的NCD依赖型氧化还原酶筛选平台，并用于NCD依赖型DXR的定向进化，构建NCD(H)介导的异戊烯焦磷酸合成选择性调控新系统。.首先，本项目敲除大肠杆菌内源L-苹果酸糖异生途径关键基因，引入NCD合成模块和NCD依赖型苹果酸酶突变体，获得系列工程菌株；以具有NCDH活性的氧化还原酶突变体为模型，测试、验证发现该菌株在以L-苹果酸为唯一碳源时可作为生长耦联型NCD依赖型氧化还原酶筛选平台；其次，利用生物信息学和结构生物学信息设计DXR突变文库，采用RF克隆、噬菌体辅助连接和易错PCR的方法构建半理性和随机突变文库，分别采用340 nm吸光度变化和生长偶联筛选平台进行定向进化，获得多株偏好利用NADH的突变体，可作为后续DXR定向进化的模板；为进一步拓展NCD(H)介导的选择性调控体系，将NCD合成模块引入酿酒酵母和圆红酵母，通过添加前体或增加前体代谢流获得系列NCD自给表型；优化NCD的酶法合成及分离纯化路线，提高全过程产率至82.5%（化学法为30%），单次试验可制备克级纯度为95%的NCD产品；将不同NCD还原及NCDH利用模块与NCD合成模块进行组装，获得了以L-苹果酸、亚磷酸和甲酸提供还原力的选择性调控新系统。以上部分研究成果已在《自然-通讯》等重要学术刊物发表。.本研究解决了NCD依赖型氧化还原酶元件筛选通量低、底物消耗量大的难题，提供了通用的生长耦联型NCD依赖型氧化还原酶筛选平台，获得了一批NCD自给的大肠杆菌、酿酒酵母和圆红酵母平台菌株及NCDH还原力供给、利用模块，为基于NCD(H)的选择性调控系统建立了新模型，为基于人工辅酶NCD的合成生物学和化学生物学研究提供新工具、新材料和新思路，对构建萜类化合物细胞工厂具有重要参考价值。

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