用于非整倍体快速诊断的多重不对称PCR偶联高灵敏焦磷酸测序新方法

Aneuploidy is an abnormal number of chromosomes due to an extra or missing chromosome in cells. Current methods have drawbacks such as time consuming, high cost, complicated operations and low sensitivity, thus leaving the requirement for clinical tests unsatisfied. Therefore, segmental duplications, which are DNA segments of nearly identical sequence in different chromosomes, are introduced to this study as biomarkers of aneuploidy. Moreover, a multiplex asymmetric PCR is proposed to produce single-stranded DNA by using a minim volume of amniotic fluid or umbilical cord blood as starting material without DNA extraction. Based on the novel PCR method and a highly sensitive pyrosequencing reaction, we will raise a strategy for aneuploidy diagnosis by quantitatively analyzing the peak height ratio of different bases on “segmental duplications” by pyrosequencing, thus realizing the prenatal diagnosis of several common aneuploidy in one assay. Comparing to current methods, this method costs less time and money, while reaches high sensitivity and accuracy, enabling the rapid detection of aneuploidy in clinic.

非整倍体是由细胞中个别染色体的增多或减少而形成的染色体数目异常。现有的诊断方法存在检测时间长、成本高、操作繁琐、灵敏度低等缺点，无法满足临床实际需求。本项目拟引入不同染色体上序列相似的“片段重复”作为检测标志物，建立不经核酸提取过程、以极少量羊水或脐血为起始材料直接进行扩增反应的新方法，发展可使扩增产物含大量单链模板的新型多重不对称PCR技术，结合高灵敏焦磷酸测序反应体系，提出基于焦磷酸测序定量测定“片段重复”中差异碱基的比例来分析非整倍体的新策略，实现一次测定即可同时对几种常见的非整倍体进行快速准确诊断。与现有方法相比，本项目建立的新方法具有检测时间短、成本低、灵敏度高、准确率高等优点，为临床非整倍体快速诊断提供一种新的有力工具。

非整倍体是由细胞中个别染色体的增多或减少而形成的染色体数目异常。现有的诊断方法存在检测时间长、成本高、操作繁琐、灵敏度低等缺点，无法满足临床实际需求。本课题在前期研究建立的基于焦磷酸测序的非整倍体诊断方法的基础上，选择了染色体“片段重复”这一新的标志物进行检测，结果表明“片段重复”作为一种新的非整倍体检测靶标具有简便易行、覆盖率高、敏感性强等优势。同时，本课题对焦磷酸测序技术本身进行了相应的改进，使其更加适合临床检测的需求。首先，通过优化PCR反应体系，抑制样本中的聚合酶干扰物，建立了羊水或脐血直接PCR扩增方法。该方法无需DNA提取，大大节约了检测时间和成本，也避免了样本间的交叉污染，所需样本体积仅为核型分析的十分之一；通过离心富集和高温处理，将扩增起始模板量提高了1000倍，显著简化了羊水扩增前的预处理步骤。接着，我们针对所筛选出的每个“片段重复”靶标，设计一对5’端区域为与模板序列不互补的公用序列、3’端区域与靶标序列互补的特异性引物，建立了公用引物介导的多重PCR扩增方法，使一次PCR反应可扩增多个靶标。最后，我们通过研究焦测序反应背景信号的产生原因，对反应体系中四种酶及底物的浓度分别进行了优化，显著降低反应液的背景信号，提高焦测序反应灵敏度。.以母血游离DNA作为检测样本可以实现对胎儿非整倍体异常的无创诊断，但由于存在大量母亲来源的DNA干扰，常规方法难以对非整倍体异常患儿所引起母血游离DNA中相应染色体数目的微量变异进行检测。为此，我们研究建立了基于数字化PCR方法的游离DNA基因标志物检测新方法。利用数字化PCR技术对游离DNA中的“片段重复”、基因甲基化等标志物进行高灵敏、高特异的精确定量检测，以实现对染色体非整倍体的无创诊断。.综上，本课题所创建的非整倍体相关基因标志物的检测新方法，实现了对相关靶标的高灵敏、高特异的快速准确检测，为非整倍体产前诊断提供了一个有力工具。

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