一种动态时序调控级联线路的构建及其对琥珀酸合成的调控机制研究

In the engineered strain for succinate production, the temporal expression of the genes involved is critical to improve the yield of succinate. To overcome the problem, this study for the first time constructs a cascade expression system based on quorum sensing and AND logic gate. In an effort to expand the utility of the genetic circuit system, we will create a mutant library of LuxR and TraR that activate at different cellular densities. The isolated mutant proteins and promoters will be re-assembled to the LuxR-TraR cascade circuits with the characteristics of different cell density threshold values and response times. These engineered cascade circuit will offer an auto-induction temporal program of gene expression and regulate genes involved temporal expression. By analysis of the amplified gene expression capacity, response times and steady-state sensitivity of the regulatory cascade system, as well as the changes of metabolites and succinate production, the molecular foundation and action mechanism of the cascade circuit can be discovered. Metabolic flux analysis will be used for further optimizing the engineered strain. The success of this study will offer a novel and efficient gene temporal regulation system, not only extend the tool box for metabolic engineering research but also a powerful complementarity for biotechnological applications.

如何调控基因的动态时序表达，是合成生物学和代谢工程研究中普遍面临的难题。而在本实验室已构建的合成重要平台化合物琥珀酸的工程菌中，提高琥珀酸转化率的关键，也是如何实现其相关基因的动态时序表达。为此本项目创新性地将双调节蛋白级联的时序表达、群体感应的动态自诱导和AND逻辑门精确调控的各自优势有机结合，辅以定向进化等手段，构建出一系列时序和表达强度不同的级联线路，它们能够动态时序调控基因的表达，并且具有自诱导和通用性强的特点。我们进一步将该级联线路，应用于琥珀酸代谢途径中以提高其转化率，通过分析级联线路本身及组成元件的特性，探究级联线路对琥珀酸合成途径中代谢产物、相关基因转录和酶活水平以及代谢流量分布的影响，阐明动态时序调控级联线路作用的分子基础，以及对琥珀酸合成代谢流的动态时序调控机制。本项目获得的成果可以作为合成生物学的通用基本装置，同时也为基因动态时序调控提供一个新的研究思路和理论基础。

如何调控基因的动态时序表达，是合成生物学和代谢工程研究中普遍面临的难题。动态分配代谢流是解决细胞工厂生产和生长平衡的有效方法。为此本项目创新性地将双调节蛋白级联的时序表达、群体感应的动态自诱导和CRISPRi精确调控的各自优势有机结合，辅以合成生物学等手段，构建出一系列时序和表达强度不同的级联线路。首先我们构建了群体感应Las、Tra系统，Lux、Tra系统QS模块，完成后对该模块的信号串扰情况进行验证。选择LasI、LuxI分别作为HSL合成酶基因来构建自诱导表达级联线路。在本线路中，主要是通过调节LasI自诱导物合酶和TraR、LasR调控蛋白的表达强度，来实现级联线路表达时间差的多样性。从IGEM网站中选取了多个不同强度的启动子和RBS对LasI合酶和TraR调控蛋白进行调控，得到不同的时间差范围从110min到325min的自诱导级联线路工具库。分析启动子和RBS的强度与自诱导级联线路的时间差之间的规律。构建完成一系列时序和表达强度不同的级联线路。并探索分析出该级联线路的作用机制。.进一步将这一系列级联线路应用于可降解塑料PHA合成的动态调控中，解决了代谢流从TCA循环动态切换到PHA合成途径的目的。在自诱导级联线路应用中引入CRISPRi系统动态抑制TCA的循环。选取了两组菌株（先生产PHB后抑制TCA循环和先抑制TCA循环后生产PHB），且它们调控间隔的时间不同。发酵结果显示先生产PHB后抑制TCA循环的这组实验，PHB含量和产量具有时间差越大，含量越高的趋势。通过对自诱导级联线路时间差工具库的应用，我们选择出了最优生产PHB的时间差线路，产量提高达57%，与之前用于验证自诱导级联线路有效性的菌株相比，其产量和含量具有均有提高。本项目获得的成果可以作为合成生物学的通用基本装置，同时也为基因动态时序调控提供一个新的研究思路和理论基础。

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