肝癌特异性表达基因启动子中关键模体的筛选及其介导小干扰RNA抗肿瘤的研究

Molecular therapy using small interfering RNA (siRNA) shows great promise in the development of novel therapeutics for hepatocarcinoma. However, non-specific expression and safty issues of siRNA limit its use in clinical applications. In our previous study, we found that some key motifs exist in the promoters of Hepatocarcinoma specifically expressed genes. The key motifs are essential for the regulation of specific expression in cancers. The screening and application of these key motifs will reduce non-specific expression of siRNA and improve its safty. According to this finding, we will screen key motifs in promoters of four Hepatocarcinoma specifically expressed genes by bioinformatics analysis and experimental verification. These key motifs will be assembled and optimized to get Hepatocarcinoma specifically expressed regulatory elements. These regulatory elements will be use to mediate siRNA of the four genes against tumor. The results of this study may provide a new idea for elucidating the underlying mechanisms of Hepatocarcinoma specifically expression and an important foundation for improving the therapy of Hepatocarcinoma using siRNA.

利用小干扰RNA治疗肝癌是近年兴起的非常有前景的治疗手段之一。该方法由于受到非特异性表达和安全性等问题的影响，限制了其在临床上的应用。本研究组在肝癌特异性表达基因的相关研究中发现在启动子区域存在一些调控肝癌特异性表达基因表达的关键模体。这些关键模体的获取及使用，将有助于减少肝癌治疗中siRNA的非特异性表达并提高其安全性。为此，本研究首先通过生物信息学结合实验验证的方法获得四种肝癌特异性表达基因启动子中的关键模体，优化重组这些关键模体形成肝癌特异性表达调控元件，再利用此调控元件介导四种特异性表达基因的siRNA进行抗肿瘤的研究。研究结果将为阐明肝癌中特异性表达基因的表达机制提供新的思路，也为利用小干扰RNA治疗肝癌的改进提供必要的实验依据。

肝癌死亡率在所有癌症中位居世界第四，在男性中更是位居世界第二。在肝癌中某些特异性表达的基因对肝癌的发生发展起着重要的作用。研究发现启动子对这些基因的转录调控起着重要的作用，从而影响这些基因在肝癌组织中的差异性表达。启动子区域的模体可能起着关键作用。本研究首先对肝癌细胞和正常肝细胞中AFP、CLU、DKK1、GP73和ACRBP的差异性表达量进行检测，结果表明五种基因在肝癌细胞中的表达量均高于正常肝细胞，其中AFP和GP73基因的表达量远远高于正常肝细胞中的表达量。TCGA数据分析表明肝癌组织中DKK1、AFP、GP73和ACRBP的表达量也均高于正常组织。通过PCR扩增和测序后合成方式获得AFP、CLU、DKK1、GP73和ACRBP的启动子并构建成表达载体。肝癌细胞基因组测序结果表明AFP、GP73和ACRBP的启动子区存在突变位点。利用双荧光素酶报告基因法检测启动子活性，结果表明8种启动子中DKK1、GP73、CLU、和ACRBP的启动子均具有肝癌靶向性；其中GP73的启动子活性高于阳性对照SV40的启动子活性，具有很好的应用价值。同时检测发现的启动子中的突变位点对肝癌细胞中的启动子活性有影响，从而确定其为具有重要调控作用的模体。之后利用生物信息学方法对所有启动子中的模体分析发现具有共同的模体。此外利用生物信息学分析GEO和TCGA数据库中的肝癌中的差异表达基因，共筛选出与肝细胞癌相关的相同差异基因187个，包括高表达基因55个和低表达基因132个。同时通过分析TCGA数据库中差异表达的mRNAs、miRNAs和lncRNAs构建肝癌ceRNA网络并筛选相关lncRNA，结果发现其中有2个mRNAs，2个miRNAs和3个lncRNAs跟预后相关。上述研究结果对肝癌中特异性表达的基因的进一步研究具有重要意义，筛选获得的启动子可进一步用于肝癌的靶向治疗。

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