降低慢病毒载体转录“通读率”的研究

Lentiviral vector is an important vehicle for gene transfer and gene therapy. However, due to the deletion of U3 promoter in the third generation of lentiviral vector leading to the lost of Upstream sequence element (USE) for transcriptional termination simoutaneously. Such a deletion, results in weakening the transcriptional terminational function leading to the increase of the probability for continuing trancribing downstream DNA at the transcriptional termination signal ("read-through"), which raises a bio-safety issue especially when the pseudovirus lands to the upstream of an oncogene. To reduce the "read-through" risk, some extra USE and insulators were introduced into △U3 with appearing of some extent of effects. Based on our previous achievement on deletion of most part of viral backbone after integration while maintaining the transgene, which leads to the probability of "replication-competent lentivirus" formation almost impossbile, we here attempt to further reduce lentiviral vector "read-through" rate by either using the combination of USE with insulator, or introducing some extra terminational signal, R, or screening out new insulators. Combining with our previous achievement on "suicidal" lentiviral vector, we aim to make our lentiviral vector close to the requirments for the clinical application.

慢病毒载体是目前基因转导和基因治疗的重要工具。但是以删除U3启动子为标志的第三代慢病毒载体却因此删除而造成其转录本在3'不能被完全终止而"通读"，由此可能激活下游原癌基因等而导致安全隐患。虽然科学家们已通过插入隔离子等方法来降低转录"通读率"，但仍未能完全消除转录"通读"。因此深入开展提高慢病毒载体的安全性的研究具有重要的意义。我们先前在慢病毒载体整合入染色体后，在保留它所携带的外源基因的同时，删除了其大部分的病毒元件，使之几乎不可能形成"重组相适应性慢病毒"。在此基础上，本课题拟进一步通过叠加已被证实有效降低转录"通读率"的不同类型的元件，或引进多个转录终止信号R,或筛选新的小分子隔离子，以及组合上述研究结果，在不显著降低"假病毒"滴度的前提下，进一步降低慢病毒载体的转录"通读率"，并与我们已取得的在慢病毒载体引进自删除的研究成果相结合，力争使我们的慢病毒载体能够基本达到临床使用的要求。

随着精准医疗、干细胞技术以及基因治疗载体技术的快速发展，这几年，基因治疗又被重新提到了一个越来越重要的位置上。而慢病毒载体在其中扮演着一个重要的角色。.本项目的研究目的是在第三代慢病毒载体的基础上，通过对载体的改造，来改善其由于大部分的U3区被删减，而造成的上游转录本在3'不能被完全终止，进而转录"通读"至整合位点的下游。此一现象的发生，有可能造成激活下游原癌基因等而产生安全隐患。.通过设计10套优化慢病毒载体转录通读率的方案（附件1）。我们在三个层面（pEGFP-N1报告基因载体系统、FUGW转移载体系统和模拟原病毒载体系统）（附件1），分别在RNA和蛋白两个水平上检测了的转录通读率（附件1，附件2，附件3）。最终筛选出三种原创的，优于已报导的有效改善转录通读的方案（附件1，附件4）。F、C-U、和2.4C-这三种元件在插入慢病毒载体后，我们观察到了其有效降低转录通读率，达到几乎为零的程度，优于野生型的HIV-1的转录通读率（附件4）。在此基础上，我们研究了这些元件的插入，对慢病毒载体的颗粒数以及整合率等生物特性的影响。我们发现它们对产病毒的颗粒数影响不大（附件5）。另外，将泡沫病毒嵌合体LTR的载体，F慢病毒载体感染293T细胞后，我们检测了其整合在染色体上的LTR的完整性。并且发现大约十分之一的F病毒整合在染色体上的LTR是不完整的（附件6）。因此，我们针对F病毒的LTR的完整性进行了优化筛选。经优化后的F病毒载体，在染色体上，没有发现有不完整的LTR产生（附件7）。与未优化的F病毒相比，优化的F病毒载体的转录通读率和生物滴度基本相似（附件6）。至此，我们成功地构建了转录通读率几乎为零的、在染色体具有完整的LTR的、更加安全的慢病毒载体。这载体保留了其能够在非分裂细胞（如：小鼠神经原细胞）的有效感染和表达的能力（附件8）。此项研究成果，被用于申请了专利（附件11，12）。我们的慢病毒载体安全性改进的研究成果，使之能够进一步满足临床基因和细胞治疗的安全要求。同时，也使我们圆满地完成了本课题的研究任务。

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