重离子辐射诱变高淀粉浮萍的筛选及其分子机理

Due to its superior characteristics, such as high relative biological effectiveness, wide spectrum of mutation, higher mutation efficiency, and the lower recovery rate of DNA damages induced, heavy-ion irradiation mutagenesis has been utilized as an efficient method in plant breeding. In addition, the loss-of-function mutants generated by heavy-ion irradiation mutagenesis enormously facilitate plant functional genomics studies using reverse genetics means. Due to the characteristic of rapid growth and high starch content, duckweed has been considered as an ideal feedstock for bioethanol production. In the previous study, we had established heavy ion irradiation mutagenesis system using duckweed callus. A mutant with starch content increased by 15% had been obtained from 900 mutants. In this project, we will establish bigger heavy ion irradiation mutant bank and screen more high starch duckweed mutant. Then, we will preliminary analyze the reason caused starch content increased in the mutant. In addition, we will characterize the aberrance of chromosome structures including SNPs, InDels and CNVs induced by heavy-ion irradiation mutagenesis at the genome level as well as the differential expression protein at the protein level. To fulfill this goal, array-based comparative genomic hybridization (array-CGH), high-efficiency melting curve analysis and proteomics technology will be performed. The results obtained will provide novel insight into the molecular mechanism and biological effectiveness induced by heavy-ion irradiation mutagenesis, thus may lay the foundation for new cultivar breeding by heavy-ion irradiation mutagenesis and functional genomics studies in duckweed.

重离子辐射诱变具有相对生物学效应高、突变谱广、突变率高、DNA损伤修复率低等特点，已经成为植物品种改良的重要手段。此外，诱变突变体也可用于基因功能研究，成为反向遗传学的重要研究手段。浮萍生长速度快、淀粉含量高，是一种极具有应用前景的淀粉类能源植物。本项目前期建立了浮萍愈伤重离子辐射诱变体系，获得900个突变体并筛选到一个淀粉含量提高15%的突变株。以此为切入点，本项目将继续辐照浮萍，筛选高淀粉突变体，对其高淀粉特性进行深入分析，借助微阵列比较基因组杂交技术（array-CGH）、高分辨率熔解曲线分析（HRM）和蛋白质组学等手段，在基因组水平上对重离子辐射诱变引起的染色体结构变异（SNPs, InDels, CNVs等）进行全面筛查，在蛋白水平上对重离子辐射诱变引起的差异表达蛋白进行鉴定，将进一步丰富对重离子辐射诱变效应及其作用机理的认识，为浮萍重离子辐射诱变育种和功能基因组学研究奠定基础。

重离子束作为一种新兴的辐射诱变源，具有生物诱变作用强、诱发突变谱广、突变率高、DNA损伤修复率低等优点，已经成为植物品种改良的重要手段。通过重离子辐射诱变的突变体除了直接或间接用于植物品种的改良之外，一些具有重要突变性状的突变体也可用于基因功能的研究，成为正向遗传学的重要研究手段，推动了功能基因组学的研究。本研究以极具有应用前景的淀粉类能源植物浮萍为研究对象，利用愈伤组织进行重离子辐照，计算致死率和突变率，优化辐照条件，筛选用于浮萍辐照的最佳辐照剂量。建立浮萍愈伤重离子辐射诱变突变体库（2000份以上），在此基础上利用淀粉染色和淀粉含量测定等方法对突变体库进行大规模筛选，最终获得5株淀粉含量提高10%以上突变体。进一步对其中一株高淀粉突变体进行机制解析，测定其生长、光合作用和淀粉积累相关指标，利用转录组学等技术对重离子诱变效应和机制进行分析，结果显示高淀粉突变体光合作用捕光天线相关蛋白、光合作用、碳固定、苯丙素代谢、生物素代谢、植物和病原菌互作、昼夜节律、乙醛酸和二甲酸代谢等代谢通路显著性富集。在此基础上，从高淀粉突变体转录组数据中鉴定了一个参与调控淀粉高效积累的TZF2转录因子，发现该基因过表达株系淀粉含量显著高于对照，RNAi株系淀粉含量显著低于对照，通过一系列的生理和生化实验，深入揭示了其参与浮萍淀粉积累的分子调控机制。另外为了深入研究重离子诱变机制解析获得的淀粉高效积累关键调控基因，我们建立了高效的浮萍遗传转化和基因编辑平台，为项目后续继续深入研究奠定基础。. 目前已完成项目预期各项研究指标，发表了SCI论文4篇（Plant Biotechnology Journal，Biotechnology for Biofuels，Chemosphere和Plant Biology），截止2019年12月份，引用次数已达30余次。授权国家发明专利3项，受理国家发明专利2项。培养了1名博士后，1名博士研究生和1名硕士研究生，1名硕士研究生预计2020年毕业。培养了3名中青年科研骨干，其中2名已由助理研究员晋升为副研究员，1人入选了中国科学院青年创新促进会。

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