硫化叶菌中Cren7蛋白在染色体组织中的作用

本课题组发现了泉古菌硫磺矿硫化叶菌中一种新的核酸结合蛋白Cren7，该蛋白在细胞内含量很高，而且体内与DNA结合。序列分析的结果显示，Cren7在泉古菌中高度保守，是目前已知在泉古菌中最为广泛存在的染色体蛋白。因此，研究Cren7蛋白在染色质组织中的作用对揭示泉古菌中染色体的包装机制有着非常重大的意义。本课题拟通过体外、体内两方面进行研究：首先，利用AFM等先进技术手段，详细检测Cren7蛋白对DNA结构的影响，构建物理模型分析蛋白与DNA的相互作用，并深入分析Lβ3β4在结合DNA与固定负超螺旋中的功能；其次，利用基因敲除、敲低等手段改变Cren7的表达量，观察染色体的变化；最后，与Sso7d蛋白进行全面的比较，阐明Cren7蛋白在染色体包装中的作用。为揭示泉古菌染色体组织方式，破解极端嗜热古菌在高温下（80℃或更高）维持染色体稳定、进行DNA复制的机制打下基础。

泉古菌染色体DNA包装机制一直是学界的热点，本项目围绕泉古菌染色质蛋白Cren7展开研究，拟利用生物化学以及遗传学的方法从体外、体内两个方面分析Cren7蛋白的生理及生化性质，进而阐明其包装DNA的分子机制。经过三年的工作，本项目的研究计划已基本完成，在以下3个方面取得了重大的突破：(1) 我们解析了Cren7与不同序列的8 bp DNA复合物的晶体结构，分析了Cren7的DNA结合界面。将其与Sul7d蛋白进行比较，二者的DNA结合界面有三个区别，其中Cren7蛋白的loop β3-β4区域是最显著的。因此我们利用突变实验分析了loop β3-β4上残基的作用，发现该loop区域碱性氨基酸残基的数目对Cren7蛋白的生化性质有明显的影响；(2) 对Cren7的DNA结合界面上所有残基进行了突变分析，确定了影响Cren7蛋白结合DNA及固定DNA负超螺旋的两个关键残基（Leu28和Arg51）。根据Cren7-DNA复合物晶体结构，我们推断这两个残基的DNA变形是Cren7固定DNA负超螺旋的结构基础。对Leu28和Arg51进行了进一步的突变分析后，发现Cren7固定DNA超螺旋的能力依赖于28位氨基酸的侧链长度以及51位氨基酸的侧链长度和极性；(3) 我们利用AFM研究了Cren7与长片断DNA形成的复合物结构，结果显示低浓度时Cren7平均分布在DNA上，而高浓度时则会引起DNA分子内的压缩包装。为了解Cren7包装染色质纤维的结构基础，我们解析了18bp DNA 结合2个Cren7分子的复合物晶体结构。在晶体中，两个Cren7分子均结合在DNA小沟中，对称分布在DNA的两侧，在DNA上头尾相接排列。以上进展极大的推动了对泉古菌染色体包装机制的理解，有助于阐明Cren7在细胞内的生理功能。本项目的部分相关工作在微生物学领域顶级期刊Mol Microbiol上发表文章1篇，其他内容在整理投稿中。项目负责人在2011年中国-丹麦古菌学及生物技术研讨会作特邀报告1次。

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