Fos家族即刻早期基因在斑马鱼低温适应中的功能与机制研究

Acclimation of organisms to environmental stresses is dependent on fine-tune regulation of gene expression. Transcription factors are known to play critical roles in the regulation of gene expression, so the characterization of cold-responsive transcription factors is important for exploring mechanisms of cold acclimation in fish. We previously found that zebrafish fos family transcription factors fosaa, fosab and fosb are cold-inducible immediate early genes and overexpression of Fosaa and Fosab in zebrafish larvae significantly increased their resistance to lethal cold stress. In addition, inhibiting the activity of Fos family protein complex AP-1 eliminated the cold acclimation response in zebrafish larvae. This project is aimed to verify the roles of these immediate early genes in the cold acclimation of zebrafish and investigate the underlying mechanisms. The main contents include: 1) develop gene-knockout zebrafish lines for these genes; 2) characterize the effect of lacking fos family genes on the cold acclimation of zebrafish; 3) investigate the upstream signaling pathways that mediate cold-inducible responses of these immediate early genes and identify cold-responsive cis-elements; 4) identify proteins that can interact with these immediate early factors and downstream genes regulated by these immediate early genes. The approval and successful implementation of this project is of theoretical significance for revealing mechanisms underlying intracellular cold-stress signaling and acclimation in fish and for breeding fish strains with cold tolerance.

生物体对环境刺激的适应依赖于基因表达的精细调控，因此研究调控低温反应的关键转录因子对于认识鱼类的低温适应具有重要的意义。我们在前期研究中发现斑马鱼fos家族转录因子fosaa、fosab和fosb是响应低温刺激的即刻早期基因，过表达Fosaa和Fosab能显著增强斑马鱼幼体的低温耐受能力，而抑制Fos家族蛋白功能复合体AP-1的活性可消除斑马鱼幼体的低温适应能力。本项目在前期研究基础上进一步验证这些基因在斑马鱼低温适应中的功能并研究其作用机制，主要内容包括：1）研制各基因的基因敲除斑马鱼品系；2）研究缺失fos家族基因对斑马鱼低温适应的影响；3）研究调控这些基因响应低温刺激的上游信号通路，鉴定其启动子中的低温反应元件；4）鉴定各基因编码蛋白的相互作用蛋白及其调控的下游基因。本项目的顺利实施，对于深入揭示鱼类低温信号传导和低温适应的分子机理，指导鱼类的抗寒育种具有重要的理论意义。

鱼体对低温刺激的适应性反应是增强低温耐受能力的根本途径，是其基因组和环境相互作用的结果。我们的前期研究发现，斑马鱼96hpf的幼苗在18℃适应6h就能显著增强对10℃致死低温的耐受能力，但是低温适应的遗传调控机制还不清楚。在本项目中，我们将96hpf的斑马鱼幼苗在18℃处理不同时间后采用RNA-seq研究基因表达，揭示了低温适应早期基因表达的动态特征，鉴定到fosab和fosb等低温诱导的即刻早期基因。为了研究Fos家族即刻早期基因在调控鱼类低温适应中的功能和作用机制，我们采用CRISPR-Cas9系统研制了fosab和fosb的基因敲除斑马鱼品系。这两个基因敲除品系的低温耐受能力都显著低于野生型，但都还具备低温适应能力，说明Fosab和Fosb在决定斑马鱼的低温耐受能力中具有重要作用，同时也说明还有其他因子参与低温适应的调控。收集在18℃适应6h和没有进行低温适应的突变体和野生型鱼苗进行RNA-seq，鉴定Fosab和Fosb调控的下游基因。结果表明，受fosab突变影响的低温响应基的因数目很少，说明Fosab对低温耐受能力的影响不是通过调控大量低温响应基因的表达来实现的。低温处理条件下，参与诱导细胞死亡和肿瘤坏死因子反应等生物学过程的基因在fosab突变体中异常高表达。这些凋亡诱导基因的表达水平与在致死低温条件下暴露的时间（低温损伤程度）密切相关。因此，我们推测Fosab通过抑制凋亡诱导基因的表达来发挥组织保护功能。Fosb在低温响应基因的表达调控中具有重要的作用，其可能通过激活生物钟和组蛋白乙酰化酶基因的表达来调控下游的低温响应基因。我们还发现PKC、ERK和P38 MAPK等蛋白激酶激酶参与低温对fosab等即刻早期基因的诱导表达。总之，本项目的研究证明了Fos家族即刻早期基因在调控斑马鱼低温耐受和低温适应中的功能，初步揭示了其作用机制，对深入认识鱼类抗寒性状的遗产决定基础和指导鱼类抗寒育种具有重要的意义。

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