木犀草素阻断NS2B/NS3蛋白的分子机制及其与Furin蛋白途径协同抑制登革病毒复制的研究

The development of multi-target synergistic drugs is a hot spot for the development of anti-dengue virus drugs. Clinical treatment of dengue fever with traditional Chinese medicine has shown some advantages, but its pharmacokinetics basis and molecular mechanism remain to be elucidated. In the previous studies, the project team has performed antiviral drug screening about 70 kinds of Chinese herbal medicines, which reveals that Viola yedoensis extract can inhibit the replication of dengue virus. In addition, the team has conducted bioactivity-guided isolation of the different components from Viola yedoensis, and demonstrated that luteolin is the main active substance, which can hinder virus maturation through inhibiting host protein Furin from splicing the immature viral protein prM.（Peng et al., Antivir Res, 2017) Subsequent screening of resistant strains showed that luteolin has a novel mechanism to inhibit the NS2B-NS3 protein simultaneously. The present project will carry out the research about the influence of luteolin on NS2B / NS3 protein activity and their interaction through Surface Plasmon Resonance (SPR) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC). Molecular docking will be employed to predict the binding sites of drugs and proteins, and single-site mutation strains, prM T79R and NS2B I114M, and double-site mutant strains, prMT79R-NS2b I114M, will be constructed by reverse genetics before evaluating the tolerance differences of luteolin among these mutation strains.The eventual objective is to verify the molecular mechanism of luteolin’s "multi-target" inhibition of DENV replication and lay the foundation for further design of "multi-target" anti-dengue drugs.

多靶点协同抗登革病毒药物的研发是目前的研究热点。临床中医药辩证治疗登革热疗效确切，但其药效物质基础及分子机制尚不明了。课题组前期从紫花地丁中发现抗登革病毒活性成分“木犀草素”，其通过抑制宿主Furin蛋白对病毒prM蛋白的剪切阻碍病毒成熟（Peng et al., Antivir Res, 2017）。进一步的耐药株筛选试验发现木犀草素同时抑制在病毒成熟及复制中至关重要的复合蛋白NS2B/NS3。本项目开展木犀草素对NS2B/NS3蛋白活性影响的研究，通过SPR、ITC研究其相互作用，采用分子对接技术预测结合位点和构相；通过反向遗传学技术获得单位点突变毒株和双位点突变毒株，考察不同位点突变株对木犀草素耐受性的差异，研究其抑制Furin蛋白途径、NS2B/NS3途径及双途径协同抑制对病毒复制的影响，探讨其协同抗病毒机制，为进一步设计“多靶点”的抗登革病毒药物奠定基础。

课题组前期从紫花地丁中发现抗登革病毒活性成分木犀草素（Luteolin），其通过抑制宿主Furin蛋白对病毒prM蛋白的剪切阻碍病毒成熟。Luteolin 还非竞争性地弱抑制重组登革病毒 NS2B/NS3 蛋白酶 (Ki 140.36muM)。为了进一步探索抑制机制，我们通过在增加浓度的木犀草素的情况下连续传代 DENV2 来分离抗性突变体。木犀草素抗性逃逸突变体的核苷酸序列分析揭示了导致 prM (T79R) 和 NS2B (I114M) 基因中氨基酸取代的核苷酸变化。将这些突变引入 DENV2 感染性克隆，并在 Huh-7 细胞中进行复制测试。有趣的是，我们发现 prM T19R-NS2B I114M 双突变体 (DM) 的复制动力学与野生型病毒 (WT) 相似。另一方面，prM T79R 单突变体（SM1）被减毒，NS2B I114M 单突变体（SM2）显示出增强的复制。木犀草素的药物添加时间分析表明，突变病毒能够以DM＞SM2＞SM1＞WT的顺序产生比WT更成熟的病毒粒子。将弗林蛋白酶外源添加到纯化的未成熟 WT 或突变病毒中表明，木犀草素以相似的水平阻止了 WT 和 SM2 的 prM 裂解。另一方面，SM1 未成熟病毒显示出一些切割，而 DM 未成熟病毒显示出有效的 prM 弗林蛋白酶切割，即使在 50muM 木犀草素存在下也是如此。我们的研究结果表明，木犀草素对弗林蛋白酶的抑制可能发生在宿主/病原体界面，这表明病毒通过突变可能导致表面改变的关键残基突变来逃避抑制。此外，我们通过结构修饰合成了一系列木犀草素衍生物，包括木犀草素5-O修饰合成了3种木犀草素衍生物，木犀草素7-O修饰合成了1种木犀草素衍生物，对其进行了抗登革病毒的活性评价。其中木犀草素-7-对氟苯磺酰酯（7a）具有更强的抗病毒作用，结构修饰后增强了抑制Furin蛋白活性的作用，对NS2B/NS3酶的抑制作用则未见增强。进一步实验证实7a可以抑制登革病毒的蛋白质合成和病毒颗粒形成。分子对接和CETSA均证明了表明7a具有更好的与Furin结合能力。通过上述研究，我们发现了木犀草素结构修饰后抗登革病毒更好的7a。

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