一种尚未报导的高频率重组现象研究

Genetic recombination is one of the most fundermental phenomina in nature. Animals and plants have evolved to have two arms of sister chromatins randomly exchanged for each chromosome at meosis to maintain a high level of genetic heterozygosity. However, the mechanism behand such recombination remains elucidated. We observed an abnormally high rate of recombination during the construction of bacterial artificial chromosome (BAC) libraries, and such recombinaiton is independent of recombinase RecA. We hypothesize that there exists an un-reported mechanism of recombination. We propose to investigate such phenomina utilizing the BAC libraries we have constructed for human, swine, sheep, mouse, fish, orange, triichomones and fungi. This project is aimed to analyze the phenomenon and its characteristics in different species utilizing the BAC plasmid and RecA deficient E. coli. We plan to find out the key sequences or elements, including novel protein or RNAs which could subsitute the function of RecA under certain stressed conditions. This project has a potential of making an important breakthrough in the area of basic research, expecially in recombination mechanism.

重组(Recombination)是自然界最普遍最根本的遗传现象之一，高等生物生殖细胞在减数分裂前每一对姊妹染色单体间都会发生随机交换而维持高杂合度。然而有关重组的初始动力和机制尚未在分子水平上完全阐明。我们在构建多个物种的细菌人工染色体（BAC）文库过程中观察到一种不依赖于重组酶RecA的重组现象，其频率随DNA插入片段增大而大幅提高。据此我们提出科学假设：生物中还存在着一个尚未被报道的重组机制，这种机制在选择压力下启动并替代RecA而维持重组功能。本研究拟在已成功建立BAC文库群独特实验体系基础上，系统分析并阐明在重组酶RecA缺失条件下，大肠杆菌与BAC质粒及不同物种基因组间发生高频率重组的现象和特征；进而通过基因扫描、突变、siRNA、2D电泳、酵母双杂交等技术验证这种重组发生的要素、特征和物质基础，以求最终发现替代RecA的功能蛋白或RNA。本研究可能在重组机制及其应用实现突破。

课题申请时我们提出科学假设：生物可能存在着一个尚未被报道的重组机制，该机制在选择压力下启动并替代重组酶 RecA 而维持其重组功能。后续研究中关键实验数据未能可靠重复。探究原因发现前期结果使用的材料遭污染，类似的重组现象在污染被排除后不复存在。我们转而调整了研究内容。调整后的研究中我们揭示了黑色素瘤转移的分子机理，成果发表在肿瘤研究重要期刊《Oncotarget》。. 黑色素瘤在其发展过程中表现出很多类似上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）的特征，而EMT的分子机理尚不明确。TET（Ten Eleven Translocation）蛋白家族作为一类DNA主动去甲基化酶，在从良性的黑痣发生癌变并逐步恶化的过程中，表达水平逐渐下调，TET基因表达水平可能成为一个区分良性黑痣和恶性黑色素瘤的分子标志。基于DNA甲基化在肿瘤发展中的重要作用，以及TET基因家族的表达水平在黑色素瘤发展过程中的逐步下调这一特征，我们提出假设：TET基因家族在黑色素瘤发生类EMT过程和转移过程中起到重要作用。. 我们发现，在TGF-β1诱导黑色素瘤细胞发生类EMT的过程中，TET2基因和TET3基因在mRNA和蛋白水平均发生表达下调；在黑色素瘤细胞系和肿瘤组织中，TET2表达水平与EMT标志基因表达水平具有显著相关性；敲降TET2或TET3基因即能诱导细胞发生类似EMT的现象，同时多个调控EMT的转录因子表达被激活；DNA甲基化抑制剂处理能逆转TGF-β1对TET2/3的抑制作用，敲降DNMT3A基因也能激活TET2和TET3的表达；ChIP-PCR实验也发现，TGF-β1处理促进了DNMT3A与TET2和TET3启动子区的结合，故TGF-β1能通过激活TET2和TET3启动子区发生甲基化来抑制其表达。另外，在体外实验中过表达TET2基因能够逆转TGF-β1所诱导的类EMT过程；在小鼠模型中，过表达TET2基因也对肿瘤的生长和转移有所抑制。. 综上所述，我们的研究发现，TET2和TET3基因是类EMT过程的抑制因子，其启动子区甲基化所引起的表达沉默是TGF-β1所诱导的类EMT过程和肿瘤转移的机制之一。我们的研究为黑色素瘤的转移提供了一个新的表观遗传学解释。

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