饲料用β-甘露聚糖酶热稳定性机理及分子改良研究

β-Mannanase is one of the most important feed enzymes that can significantly enhance feed utilization, improve animal intestinal health and boost immune function of livestock. However, the thermoliability of β-mannanase makes it inactive after the high-temperature pelleting process of feed manufacture. Highly thermostable β-mannanase has seldom been reported, and its underlying mechanism is yet known. In the previous studies, a highly thermostable β-mannanase TlMan5A (with temperature optimum at 90℃ and retaining stability at 80℃) and a homologous (with sequence identity of 73.5%) but thermoliable β-mannanase PMan5A (retaining stability at 60℃) were identified. In the present study, TlMan5A and PMan5A were selected as the core materials. By using the multiple sequence and structure alignment, SCHEMA-RASPP algorithm for structure guided protein recombination, molecular dynamic simulation calculation over a thermal gradient and prediction of protein molecular surface charges, the enzyme thermostability-related regions, modules and amino acid sites will be identified. Based on the combination of simulation calculation, bioinformatic analysis and mutation experiment, key regions/residues and their roles will be verified. This study will reveal the molecular mechanism underlying β-mannanase thermostability and provide theoretical basis for the thermostability improvement of β-mannanase and other glycoside hydrolase enzymes.

β-甘露聚糖酶可以显著提高饲料利用率、改善动物肠道健康、提高机体免疫功能, 是重要的饲料用酶之一。但该酶的耐温性问题一直未能有效解决而不能满足饲料高温制粒的要求。目前发现的耐高温β-甘露聚糖酶很少，制约了其热稳定性机理的研究。在前期工作中，我们获得了一个具有最高热稳定性的甘露聚糖酶TlMan5A（最适温度90℃，80℃下稳定），以及一个与之序列一致性很高（73.5%）但热稳定性差的甘露聚糖酶PMan5A（60℃下稳定）。利用这对组合为核心材料，基于多序列的结构比对、SCHEMA-RASPP模块拆分和重建、梯度升温分子动力学模拟、分子表面电荷分布计算等方法，探寻与酶热稳定性相关的区段、模块和关键氨基酸位点，整合研究结果并结合结构分析与生物计算，开展进一步的突变研究和实验验证，初步揭示影响β-甘露聚糖酶热稳定性的分子机理，并为进一步的β-甘露聚糖酶及其它糖苷水解酶的热稳定性改造提供理论基础。

饲料用β-甘露聚糖酶热稳定性机理及分子改良研究项目（编号3160131156）的课题任务在2017-2019年按照研究方案和计划执行顺利。β-甘露聚糖酶可以显著提高饲料利用率、改善动物肠道健康、提高机体免疫功能, 是重要的饲料用酶之一。但该酶的耐温性问题一直未能有效解决而不能满足饲料高温制粒的要求。目前发现的耐高温β-甘露聚糖酶很少，制约了其热稳定性机理的研究。根据研究计划，我们选用一对具有典型性热稳定性差异的甘露聚糖酶TlMan5A（热稳定性极好，最适温度90℃，80℃下稳定）和甘露聚糖酶PMan5A（热稳定性差，60℃下稳定），两者序列一致性很高（73.5%）。利用这对组合为核心材料，完成了甘露聚糖酶信息搜集，序列比对，并根据区段的功能与结构将研究材料的N端区段的拆分为7个区段¬，并将其中的5个区段进行替换试验（有2个区段氨基酸序列相同），从而进一步缩小并确定影响酶分子热稳定性的关键区段或氨基酸位点。通过突变验证实验我们发现H93Y和F94Y位点为影响整个酶蛋白热稳定性的关键位置。随后利用进行梯度升温分子动力学模拟，确定与酶分子热稳定性相关的关键不稳定结构区段并进行改良；根据计算结果我们设计并完成了N端关键位点突变验证实验，在研究过程中我们还发现在酶蛋白的C端存在部分关键位点影响蛋白的构象稳定性，因此我们随后对C端的关键位点进行了优化突变、同时还尝试CBM区替换等对酶热稳定性的影响。最后我们利用酶热稳定性改造系统（ETSS）优化酶分子表面电荷分布，最终获得了耐热80℃（处理5min，剩余酶活>80%）稳定的高比活甘露聚糖酶突变体PMan5A-H93Y/F94Y/L356H/A389P（2226 U/mg）。研究项目按计划获得了预期的研究结果，揭示了GH5家族β-甘露聚糖酶热稳定性的分子机理。研究过程中发表Q1区SCI论文1篇，申请中国发明专利1项，获得了耐热的高比活甘露聚糖酶突变体1个，该突变体是目前市场上耐热性能和比活最好的甘露聚糖酶，具有良好的应用推广潜力。

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