以尿素通道蛋白UT-A1为靶点的新型利尿药的发现及其药理学研究

Urea transporter (UT) proteins, including UT-A in kidney tubule epithelia and UT-B in vasa recta microvessels, facilitate urinary concentrating function. The UT-A gene family contains at least six isoforms, generated by alternative splicing, with the largest isoform being UT-A1. UT-A1 is expressed in the kidney inner medullary collecting duct (IMCD) and plays an important role in the urine concentration mechanism by increasing urea reabsorption across the IMCD. Knockout mice lacking UT-A1 manifest a marked urinary concentrating defect associated with urinary hypoosmolality but no decrease in glomerular filtration rate and no electrolyte imbalance, especially. This suggests that a selective UT-A1 inhibitor would be a novel type of diuretic, likely with less undesirable side effects than conventional diuretics, because it acts on the last portion of the nephron. UT-A1 inhibitors may be useful as “urearetics” with a mechanism of action that maybe effective in refractory edema conditions in which conventional salt transport- blocking diuretics have limited efficacy. Recently we found a small-molecule thienoquinolin UT inhibitor, PU-48, which inhibited both UT-A1 and UT-B worked at nanomolar potency and exhibited diuretic activity. The purpose of this study was to identity potent high selectivity UT-A1 inhibitors that have better pharmacological characteristics using a high throughput target-based screening assay. Further structural modification and in vivo testing of this intriguing compound would be quite exciting.

尿素通道蛋白UT-A1是特异性通透尿素的跨膜蛋白，表达于肾脏集合管末端上皮细胞，在尿浓缩机制中发挥重要作用。UT-A1基因缺失小鼠尿浓缩能力降低，表现为显著的尿素选择性利尿，不影响机体电解质平衡。由此我们提出UT-A1可作为新的利尿药作用靶点，其抑制剂可研发成为新型利尿药的科学假说。前期工作利用UT-B抑制剂筛选模型，从化合物库中发现了UT-B/UT-A1抑制剂PU-48。其具有利尿作用，且不引起机体电解质失衡。本项目拟在此基础上对PU类化合物进行结构优化，利用UT-A1抑制剂筛选模型对PU类似物进行筛选和活性评价，以期发现对UT-A1具有特异性抑制作用，而对UT-B作用较弱的化合物，通过在体动物模型，研究UT-A1特异性抑制剂的利尿作用药效学和对肾脏尿浓缩机制的影响，应用分子生物学、生理学和药理学技术确定其作用的特异性及利尿作用机制，获得比PU-48药理学特性更好的新型利尿药先导化合物。

尿素通道蛋白UT-A1是特异性通透尿素的跨膜蛋白，表达于肾脏集合管末端上皮细胞，在尿浓缩机制中发挥重要作用。UT-A1基因缺失小鼠尿浓缩能力降低，表现为显著的尿素选择性利尿，不影响机体电解质平衡。由此我们提出UT-A1可作为新的利尿药作用靶点，其抑制剂可研发成为新型利尿药的科学假说。前期工作利用UT-B抑制剂筛选模型，从化合物库中发现了UT-B/UT-A1抑制剂PU-48。其具有利尿作用，且不引起机体电解质失衡。本项目拟在此基础上对PU类化合物进行结构优化，利用UT-A1抑制剂筛选模型对PU类似物进行筛选和活性评价，以期发现对UT-A1具有特异性抑制作用，而对UT-B作用较弱的化合物，通过在体动物模型，研究UT-A1特异性抑制剂的利尿作用药效学和对肾脏尿浓缩机制的影响，应用分子生物学、生理学和药理学技术确定其作用的特异性及利尿作用机制，获得比PU-48药理学特性更好的新型利尿药先导化合物。研究计划执行良好。成功建立了稳定表达UT-A1、AQP1、YFP-H148Q/V163S的MDCK细胞系，建成了UT-A1抑制剂筛选模型。对PU化合物结构进行了结构改造，获得了系列PU类似物，并进行了UT-A1抑制剂筛选，获得抑制效果较好、毒性小的化合物。系统评价了活性化合物的量效曲线、构效关系、抑制作用特征及其作用机制。本研究已设计、合成PU-48类化合物共4大类、46个，建立了稳定表达UT-A1、AQP1、YFP-H148Q/V163S的MDCK细胞系，用此细胞系对上述化合物进行了筛选。获得较好抑制作用的化合物3个，均无明显细胞毒性。已证实其中1个活性化合物具有可逆、竞争性抑制作用，且特异性抑制UT-A1。另2个活性化合物具有不可逆、非竞争性抑制作用，且对UT-A1、UT-B均具有抑制作用，对UT-B的选择性抑制作用强于UT-A1。其中2个活性化合物具有明显大鼠体内尿素选择性利尿作用，尿渗透压降低，不影响其电解质平衡，对尿素通道蛋白、水通道蛋白及NKCC、NCC通道蛋白表达均无明显影响。进一步通过化合物结构改造，可望将尿素通道蛋白UT-A1抑制剂研发为新型利尿药，供高血压等慢性病患者长期使用。

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