基于结构光照明的荧光干扰技术研究

Fluorescence perturbation technology is one of the best tools to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells. Currently most fluorescence pertubration experiments are conducted on confocal laser-scanning microscope (CLSM), which is based on point-scanning pattern and suffering from diffraction-limited resolution, long switching time between optical perturbation and imaging, as well as slow imaging speed. This leads to failure of direct monitoring of rapid dynamic process within the scope of the entire field of view. To study fast dynamics of proteins in live cells, new fluorescence perturbation technology has to be developed. Fluorescence perturbation and imaging method based on Structured Illumination Microscopy(SIM), especially equipped with Digital Mirror Device to generate structured illumination pattern, could realize fluorescence perturbation and generate perturbation area in particular shape. With high spatial and temporal resolution, instantaneous biochemistry process in live cells could be captured. This technique provides powerful tools for non-invasive study of protein dynamics and molecule diffusion in live cells.

荧光干扰技术是研究活细胞中蛋白质的运动特性和分子动态的重要方法，其主要手段为基于点扫描的激光扫描共聚焦显微技术，但该技术存在着分辨率受衍射极限限制、光干扰与成像切换时间长、成像速度慢等问题，导致很难在整个视场范围内观测分子快速输运的动态过程，因此，研究蛋白质在细胞内运动的瞬时动态特性必须引入新的荧光干扰实验技术。本项目提出基于结构光照明的荧光干扰技术，采用可编程的数字微镜器件(DMD)作为结构光生成器，既可以实现共聚焦技术所具备的荧光干扰能力，构建可控形状的并行光干扰和成像区域，又同时具备结构光照明显微技术的高速高分辨实时成像能力，兼顾高空间和时间分辨率的同时，大大提高对瞬时生物化学过程的时间捕捉能力，为用非侵入性方法研究活细胞内的蛋白运动和分子扩散提供有利的研究工具。

结构光照明超分辨显微镜由于其成像速度快，并且不需要特殊的荧光标记，因此是用于细胞成像最有实用化潜力的超分辨技术。到目前为止，大多数SIM仪器都是通过激光干涉形成结构化的照明图案，这使得设置非常复杂和昂贵。本项目中，我们提出一个相对简单的照明模块，它可以与常用的商业荧光显微镜连用，并把它升级成超分辨率显微镜，从而应用于荧光干扰技术研究，用于研究活细胞中蛋白质的运动特性和分子动态，其主要手段为基于点扫描的激光扫描共聚焦显微技术，但该技术存在着分辨率受衍射极限限制、光干扰与成像切换时间长、成像速度慢等问题，导致很难在整个视场范围内观测分子快速输运的动态过程，因此，研究蛋白质在细胞内运动的瞬时动态特性必须引入新的荧光干扰实验技术。本项目提出基于结构光照明的荧光干扰技术，采用可编程的数字微镜器件(DMD)作为结构光生成器，既可以实现共聚焦技术所具备的荧光干扰能力，构建可控形状的并行光干扰和成像区域，又同时具备结构光照明显微技术的高速高分辨实时成像能力，兼顾高空间和时间分辨率的同时，大大提高对瞬时生物化学过程的时间捕捉能力，为用非侵入性方法研究活细胞内的蛋白运动和分子扩散提供有利的研究工具。.我们对加载在DMD上的图像进行了优化，以获得荧光样品平面上结构光条纹的最佳调制度。 使用荧光纳米小球来表征系统的横向分辨率，并获得活细胞的超分辨图像并与共聚焦显微镜捕获的图像进行比较。动态线粒体也被实时捕获。 总之，我们提出了一个解决方案，用DMD模块化技术将商业倒置荧光显微镜升级成超分辨显微镜。该解决方案将使结构光照明超分辨显微技术可用于生命科学和医学领域的大多数研究实验室。

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