固定化O6-烷基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标签重组蛋白构象表征新方法的建立及应用

Several technologies have been developed for characterizing the conformation of immobilzed protein in previous reports. It is notable that these assays are not capable of providing any bioactive informations of the protein. To address this issue, this proposal is suggested using β2-adrenoceptor (β2-AR), a member of G-protein coupled receptors superfamily, as a probe. Firstly, O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase is fused into the C-terminal of β2-AR to oriented immoblize the receptor onto the surface of resin using the sepcific alkyl-tranferring bioactivity of the enzenmy. The immobilized protein is used to establish β2-AR chromatography. Secondly, the chromatography is utilized to determine the kinetic, themodynamic and ultra-thermodynamic behaviors of the interaction between β2-AR and Gs-protein. Moreover, the fingerprint of the aminol groups on the surface of the recptor is also characterized by time of flight-seondary ion-mass spectrometry. Nonlinear regression is used to reveal the relationship between the parameters collected by chromatography and mass spectrometry to develop a new methodology for bioactivley characterize the conformation of immobilized protein. The proposed method is finally applied in screening the bioactive compounds in Semen sinapis to construct a screening method with the properties of recognizing agonists and antagonists. This proposal is able to provide strategy for characterizing conformation of other proteins. It plays particularly important role in innovative drug discovery.

本项目针对现有固定化蛋白质构象表征方法不能给出蛋白质活性信息的问题，以G-蛋白偶联受体超家族成员β2-肾上腺素受体（β2-AR）为例，将O6-烷基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶重组至受体的C-末端，利用酶的特异性烷基转移活性，将受体定向固定在苄基鸟嘌呤修饰的树脂表面，建立β2-AR色谱新模型；以激活型G-蛋白（Gs-蛋白）为构象探针，依据受体与Gs-蛋白结合强度与受体构象定量相关的特性，用色谱法测定不同药物配体诱导后受体与Gs-蛋白结合过程动力学、热力学及超热力学参数，用飞行时间-二次离子质谱测定不同构象态受体表面氨基酸残基种类和强度，非线性拟合法获得色谱参数与质谱参数间的相关性，建立能基于固定化蛋白质信号传导活性的构象表征方法学；用该方法筛选中药白芥子的活性成分，建立能区分激动和拮抗活性的药物成分筛选方法学。该研究能为其他固定化蛋白质构象表征提供新思路，对高效创新药物的开发具有重要的实际意义。

本研究在国家自然科学基金小额项目的资助下，针对功能蛋白质可控固定化这一分析化学学科永恒的研究热点问题，以G-蛋白偶联受体超家族成员Beta2-肾上腺素受体（beta2-AR）为例，围绕受体的固定化方法及表征展开了系统的研究。通过将O6-烷基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）重组至Beta2-肾上腺素受体（beta2-AR）基因序列的碳末端，建立了以E.coli为表达载体的MGMT重组beta2-AR大量表达系统；采用三种路线探索了MGMT底物苄基鸟嘌呤衍生物的合成方法，获得了一种具有全新结构的苄基鸟嘌呤衍生物；采用酰化反应将该衍生物修饰至PEGA1900树脂表面；利用重组beta2-AR结构中MGMT与树脂表面特异性底物的烷基转移反应，将该受体以硫醚共价键固定至树脂表面，建立了受体的一步法固定新策略；采用X-光电子能谱、扫描电镜和透射电镜对固定化受体的元素组成和形貌进行了系统表征；创新性将激光共聚焦显微镜应用于固定化受体的活性表征，首次发现了固定化受体的位点特异性构象变化特性，建立了固定化受体的活性表征新方法。上述研究结果表明，与传统的定向固定化方法相比，基于酶与底物特异性共价反应的固定化方法能在固体载体表面形成均一的蛋白质单分子层，具有反应条件温和、反应效率高和可精确控制蛋白质键合量的特点；更为重要的是，由于重组蛋白质结构中MGMT与底物苄基鸟嘌呤衍生物反应的高特异性，该固定化方法能直接应用于菌体裂解液等复杂体系，避免了繁杂的目标蛋白分离纯化过程，显著提高了固定化蛋白质的活性。与现有固定化功能蛋白质表征方法相比，本研究创立的方法能准确表征固定化蛋白质的构象变化活性，填补了分析化学在固定化蛋白质活性表征方面的空白，为开展基于受体信号传导通路的药物-受体相互作用研究和高内在活性药物成分筛选奠定了方法学基础。围绕上述研究，项目组取得的重要成果体现在发表SCI论文9篇，其中提出的药物活性成分筛选新策略发表在《Science》“传统医药的科学与艺术”专题（正刊内容）；获西安青年科技人才奖1项，申请国家发明专利2项。

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