糖药物蛋白Interferonβ N-glycan的均一、人源化改造

Sugar-nucleotide是绝大多数糖基转移酶的供体，用化学合成成本极高。在一釜多酶（One-pot multi-enzyme）的糖基转移反应中原位合成Sugar-nucleotide是本项目的一个重要特色。我们最近报道了一系列GDP-Man衍生物的酶法合成方法（Lei Li et al. 2013, Org. Lett., 15: 5528–5530）。该体系可高效合成GDP-Man及其非天然衍生物GDP-ManN3等（可作为特异分子标签。）；我们鉴定了一个一个稳定、高效的Galactokinase（BiGalK），用于在合成UDP-Gal及其 GalN等衍生物（Lei li et al. 2012, Carbohydr. Res. 355:35-39）。目前，我们可酶法合成UDP-GlcNAc，UDP-Gal，GDP-Man和CMP-Neu5Ac。.多（寡）聚糖合成不需要模板，而依赖于糖基转移酶的底物特异性。本项目克隆和表达的糖基转移酶包括1,2GlcNAcT, Alg1, Alg2, PmSTI, Pd2,6ST, LgtB以及EndoM。之前，我们已鉴定了2种唾液酸转移酶糖PmSTI (alpha2,3sialyltransferase)和Pd2,6ST (alpha2,6 sialyltransferase)以及beta1,4半乳糖转移酶LgtB。1,2GlcNAcT克隆自E. coli O6:K54:H10。负责合成核心五糖的Man转移酶（Alg1和Alg2）克隆自酵母。寡糖转移酶EndoM通过全基因合成得到。LgtB的稳定性很差，在酶反应中容易失活形成絮状沉淀。我们在LgtB上融合了一段源于嗜热蛋白的标签来提高其稳定性。嗜热标签的发现见（Scientific Reports, 2014, 4: 7284）。我们还对LgtB的一个功能相近的半乳糖基转移酶WciN进行了功能鉴定，发表在（ACS Biochemistry, 2012, 51, 5804−5810）。β1,2GlcNAcT, Alg1和Alg2与MBP表达为融合蛋白。遗憾的是Alg1和Alg2没能检测到活性。. 我们从鸡蛋中提取了N-糖苷多肽作为对照和备选方案。我们初步利用商业来源的RNaseB（被EndoA水解后）和提取的多肽测试了EndoM的活性。