细菌视紫红质去折叠态和折叠中间态的单分子研究

蛋白质折叠机理是分子生物学的核心问题之一，对蛋白质去折叠态和折叠中间态的表征，是揭示蛋白质折叠机理的关键步骤。然而，由于技术的限制，对蛋白质去折叠态和中间态的研究明显滞后，成了制约蛋白质折叠机理研究的瓶颈。. 单分子荧光技术由于能够测定系统的非均一性，在研究蛋白质的去折叠态和中间态方面有着独特的优势。本项目拟将单分子荧光技术、圆二色谱技术以及快速反应动力学技术相结合，建立研究膜蛋白去折叠态和折叠中间态的有效方法，对细菌视紫红质的去折叠态进行系统研究，并直接检测和表征细菌视紫红质的折叠中间态，为对这两种状态的深入全面认识提供实验依据，这对于揭示细菌视紫红质折叠机理、构建新的折叠模型有重要意义，并为膜蛋白折叠机理和功能研究提供新的思路。这一交叉学科项目的进行将促进物理、化学和生命科学的有机结合，加快相关领域研究的发展。

膜蛋白折叠机理是膜蛋白研究的核心问题之一。但是，与水溶性球蛋白相比，膜蛋白折叠机理的研究难度要大得多，这主要是因为：1）由于表达效率低、纯化难度大，膜蛋白难以获得；2）有别于水溶性蛋白，膜蛋白的结构及折叠过程并不仅仅由其氨基酸序列决定，而是由序列和生物膜共同决定的；3）目前我们对于生物膜以及生物膜和蛋白质之间的相互作用的认识还相当有限。本项目以细菌视紫红质(BR)为主要研究对象，探讨膜蛋白的折叠机理。针对上述膜蛋白折叠机理研究中存在的问题，我们从BR以及趋化因子受体CCR3的表达与纯化、生物膜的制备及其性质研究、表面活性剂及模拟生物膜对膜蛋白稳定性的影响，以及BR折叠动力学等几个方面展开了研究，并取得了较为重要的进展。主要的研究成果包括1）建立了BR和CCR3表达纯化方法，实现了BR在嗜盐菌和大肠杆菌中的高效表达，另一方面实现了CCR3在哺乳动物细胞和大肠杆菌中的活性表达，从而为这两种蛋白的折叠机理及生物活性研究奠定了重要基础；2）从多个方面对囊泡的稳定性进行了表征，探讨了囊泡大小及构成与囊泡稳定性之间的关系，为膜蛋白折叠机理研究中囊泡的选择提供了重要的实验基础；3）利用计算机模拟技术对生物膜的性质及其与纳米颗粒的相互作用进行了较为系统的研究，为深入认识生物膜奠定了重要的理论基础；4）系统研究了BR稳定性受表面活性剂的影响，为膜蛋白纯化及折叠研究中表面活性剂的选择提供了借鉴；5）首次系统地对模拟生物膜曲率大小与BR稳定性及折叠动力学之间的关系进行了表征，并发现生物膜曲率对BR稳定性和折叠动力学都会产生明显的影响。上述成果为BR以及相关膜蛋白折叠机理的研究奠定了重要的理论和实验基础。

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