INA基因高甲基化释放游离态tubulin促进微管聚合在结直肠癌早期进展中作用及机制研究

Screening tests at an early are essential for colorectal cancer (CRC) prevention. However, mechanisms of early stage CRC remain obscure, limiting the development of biomarker screening. Here, we found that INA methylation in its promoter CpG Island was abnormal high in CRC and adenoma tissues, thus, downregulating its expression. High level of INA methylation was correlated with poor CRC prognosis. INA inhibited microtubule polymerization in vitro. Downregulating INA increased microtubule number in CRC cells, and promoting proliferation and invasion. Furthermore, we identified a characteristic of microtubule binding sites in N-terminal side of INA. Therefore, we hypothesized that downregulation of INA might attribute to its methylation and promotes development of early stage CRC via accelerating microtubule assembly by releasing unassembled tubulin from its N-terminal microtubule binding sites. Next, we will detect the growth of intestinal adenomas in INA knockout mouse models. INA-tubulin interaction will be tested by using BIAcore. Peptide array will be used to identify microtubule binding sites of INA. Further, we will explore the relationship between INA expression and microtubule drug resistance. These findings will provide evidences for effect and mechanisms of INA methylation in early stage CRC, and develop INA methylation as a potential biomarker for early stage CRC.

结直肠癌（CRC）早期筛查对疾病控制极为重要，但其早期发生发展分子机制不清楚，限制了早期生物筛查的发展。我们发现：INA基因启动子区CpG岛在CRC及其癌前病变中异常高甲基化致其表达下调，并与CRC差预后相关；INA蛋白可体外抑制微管聚合，下调INA表达显著增加CRC细胞微管数目，促进细胞增殖和转移；INA的N端含有微管结合位点特征。因此，我们提出CRC早期微管组装调节新机制：INA甲基化下调其表达，释放N端微管结合位点上的tubulin，加速微管组装，促进早期CRC恶化。本项目拟使用基因敲除鼠探讨INA敲除对肠道腺瘤生长的影响；BIAcore分析INA与tubulin直接相互作用；多肽芯片寻找INA微管结合位点；探讨INA调控微管聚合与微管药物耐药的相关性。本项目有望揭示INA甲基化在CRC早期进展中的关键作用及其分子机制，为把INA甲基化发展成辅助CRC早期筛查生物标志物提供实验依据。

DNA甲基化有助于结直肠癌恶性转化，但甲基化如何在早期阶段驱动结直肠癌进化知之甚少。 a-internexin是一种 IV 型中间丝，由INA基因编码。我们从全基因组DNA甲基化库中筛选发现：结肠腺瘤和腺癌中，INA基因位于启动子区域的 CpG岛内发生异常高甲基化。这种高甲基化优先发生在大肿瘤中，并且是结直肠癌患者总体生存期较差的预后标志物。 这种类型的表观遗传改变使腺瘤和腺癌组织中的 INA表达沉默。INA在结直肠癌细胞中的基因沉默增加了结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。 INA过表达在体外阻断了结直肠癌细胞迁移和侵袭，并在体内减少了肺转移。作用机制研究发现，INA 在体外直接抑制微管聚合并降低细胞内微管组装速率。我们还通过多肽阵列筛选确定了 INA 中微管蛋白结合位点，其位于 N 末端头部结构域，该序列通过与未聚合的微管蛋白结合并阻碍微管聚合来发挥肿瘤抑制作用。 因此，这项工作主要发现INA 的表观遗传失活是一件中间丝重组事件，对于加速结直肠癌早期微管聚合至关重要。相关研究成果发表在肿瘤学经典杂志Cancer Research [2020，80(23):5203-15]，并申请相关专利[2022，中国发明专利，202210170225.6]。.另外，在本项目的部分支持下，我们还适度拓展了标书内容外的研究。主要内容和研究成果如下：（1）发现CSF1R为新型依赖性受体，并在结直肠癌中表观遗传沉默[Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2022, 1(12): e005610.]。（2）综述了自噬在肿瘤免疫治疗中的研究进展[Cells, 2022, 11(19): 2996.]。（3）发现结直肠癌腹膜转移新机制：肿瘤相关成纤维细胞通过提供多种脂质给结直肠癌细胞，增强癌细胞膜流动性促进腹膜转移，并提出相应的应对策略[International Journal of Biological Sciences, 2022, 18(5): 1912-1932]。（4）发现钠离子载体类化合物能促进皮肤损伤修复[2020，中国发明专利，202111044412.1，202010566166.5]。

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