植物内源多位点突变ALS基因的创制及抗性功能研究

Acetolactate synthase (ALS), also referred to as Acetohydroxyacid synthase (AHAS), is the key enzyme for biosynthesis of branched-chain amino acids. However, there are several positions on ALS gene, where mutations would confer high resistance to ALS herbicides. Herbicide resistant (HR) ALS genes, mostly conferred by a single point mutation, is the molecular basis for both HR weeds and the widely-planted non-GM HR crops, such as “Clearfield” rice, wheat, canola and sunflower from BASF company. Only a few studies showed that, however, it becomes hyper-resistant to ALS herbicides when two different HR mutations simultaneously occurred on the same ALS gene. This suggests that weeds with these double mutated ALS genes could be a greater threat in the future; on the other hand, double mutated ALS genes would endow crops higher resistant level with more freedom of ALS herbicide application. However, how double mutated ALS genes confer higher level of resistance was poorly illustrated, primarily due to the difficulties to generate desired double mutations on plant endogenous ALS gene. As genome editing provides a highly-effective solution to this issue, we proposed to use the newly-developed base-editing technology by our lab to create double or multiple mutations on plant endogenous ALS gene. These double or multiple mutants will allow us to investigate the level of resistance and fitness cost for better understanding the associated mechanism. This project will not only provide novel clue for future development of HR weeds in the field, but also significantly promote breeding process by creating non-GM HR crops with higher resistance levels.

乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物中合成支链氨基酸通路中的关键酶。但是，ALS基因许多位置上的单碱基突变，能够大大提高植株对ALS除草剂的抗性。单个位点抗性突变是抗除草剂杂草和非转基因抗除草剂作物的分子基础，其抗性机理得到了广泛的研究。但是，只有少数几项研究表明，当ALS基因同时具有两个抗性突变时，对ALS除草剂具有更高的抗性水平。这意味着双突变的抗性杂草可能是未来更大的威胁；而含有双突变基因的作物则具有更高的价值。因此，双位点抗性突变具有重大科学和应用价值；但是，针对双位点突变的抗性机理尚无深入的研究。其中，最大的难点是如何在植物内源ALS基因上同时引入双位点抗性突变。本课题旨在利用本实验室建立的单碱基编辑技术在植物内源ALS基因上精准地引入双位点及多位点突变来研究它们的抗性功能及机理。本研究不仅将为抗ALS除草剂杂草的发生演化提供重要科学线索，也会为培育抗ALS除草剂作物提供重要理论指导。

乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物中合成支链氨基酸通路中的关键酶。但是，ALS基因许多位置上的单碱基突变，能够大大提高植株对ALS除草剂的抗性；并且，当ALS基因同时具有两个抗性突变时，对ALS除草剂具有更高的抗性水平。这意味着双突变基因的作物则具有更高的价值。本课题旨在利用单碱基编辑技术在植物内源ALS基因上精准地引入双位点及多位点突变来研究它们的抗性功能及机理。为此，本课题以拟南芥、水稻、小麦为材料，针对其内源ALS基因，创制了一系列在单一位置上具有不同突变类型的植物材料，以及同时具有多位点突变的新种质。抗性测试表明这些不同的单突变具有不同的抗性表型，并且多位点同时突变能够显著提高植物的抗除草剂水平。与此同时，课题主持人积极寻求多方合作，相继拓展了基因编辑工具的新功能，一是循环打靶碱基编辑策略，二是基因敲高策略。这些成果加深了人们对基因编辑工具的理解，为更好地发挥其功能提供了新的指引。在本项目的支持下，主持人培养研究生6名，发表通讯或共同通讯作者 SCI 文章 6 篇，提交专利申请一项。最后，值得指出的是，我们发现ALS基因同时具有多位点突变的种质，虽然具有更高的抗性水平，但是往往会伴随结实率低、株高矮的不良农艺性状。这方面将是我们下一步研究工作的重点。

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