探讨通过拟组蛋白磷酸化来提高肿瘤细胞对重离子的辐射敏感性

重离子肿瘤治疗仍然存在"敏感性差异"问题，而决定重离子辐射敏感性的细胞分子水平参数并不完全清楚。本项目以不同射线敏感性肿瘤细胞为研究对象，以磷酸化组蛋白γH2AX作为研究靶点，结合重离子辐照，用免疫细胞化学和激光共聚焦显微扫描、流式细胞分析、蛋白以及基因表达等方法，探讨γH2AX表达的时间和剂量效应关系及上游激酶和下游效应分子的协同作用机制；使用人工合成多肽（与γH2AX羧基末端一致）转导辐照低敏感细胞，检测12C6+离子辐照后γH2AX各参数与存活系数间相关关系，以证明γH2AX的表达差异对肿瘤细胞重离子敏感性差异的影响，及是否可以用γH2AX来预测重离子辐照的敏感性。该研究有可能使γH2AX成为重离子治疗肿瘤潜在的分子靶点，将为重离子辐照用于治疗射线耐受性肿瘤提供新途径。

研究背景 面对重离子肿瘤治疗存在的“敏感性差异”问题，本项目以不同射线敏感性肿瘤细胞为研究对象，以磷酸化组蛋白γH2AX为研究靶点，探讨γH2AX表达的时间和剂量效应关系及上游激酶和下游效应分子的协同作用机制，以证明γH2AX表达差异对肿瘤细胞重离子敏感性差异的影响，及是否可以用γH2AX来预测重离子辐照敏感性。.实验材料 选用射线低度敏感人肝癌细胞（HepG2）、射线中度敏感人宫颈癌细胞（HeLa）、射线高度敏感人黏液表皮样癌细胞（MEC-1）、ATM-/-基因缺陷的MEF细胞和DNA-PK-/-基因野生型M059K和缺陷的M059J细胞作为实验材料，检测细胞对X射线和重离子的辐射敏感性。.实验方法 采用集落形成和中性单细胞凝胶电泳法检查细胞辐射敏感性、用免疫细胞化学和激光共聚焦显微扫描、流式细胞分析、蛋白及基因表达等方法检测γH2AX表达的时间和剂量效应关系及上游激酶和下游效应分子的协同作用机制。.结果（1）对于不同辐射敏感性肿瘤细胞，重离子比X射线具有更强抑制细胞存活作用；重离子具有更强诱导DNA双链损伤(DSB)作用，照射后30min或4h，细胞呈现最强DSB，重离子照射组DSB更强，照射后16h，重离子照射细胞仍表达较高数量的DSB。（2）γH2AX焦点表达以辐照后30min最高，照射后16h，重离子照射细胞仍然表达较高水平γH2AX焦点；γH2AX表达具有时间、剂量和周期依赖性，γH2AX表达以重离子辐照细胞更高，持续时间更长；射线照射细胞呈现明显G2/M期阻滞。（3）重离子辐照细胞中磷酸化ATM（pATM）表达均以照射后30min或4h最高，照射后72h，细胞仍然表达一定水平pATM焦点；pATM表达具有具有时间、剂量和周期依赖性；重离子辐照细胞中磷酸化CHK2（pCHK2）和P53均呈现不同程度表达。（4）MEF、M059K和M059J细胞中γH2AX和pATM表达具有剂量依赖性；与M059K相比，M059J细胞中γH2AX和pATM表达高峰出现晚；照射后72h，M059K和M059J细胞仍表达一定水平pATM。.结论γH2AX表达具有时间、剂量、周期和细胞种类依赖性，激酶成员-ATM和DNA-PK及下游效应分子-- pCHK2和P53参与γH2AX磷酸化形成。γH2AX是预测重离子辐照敏感性的有效指标。

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