用于原位联动检测活性氧物种触发硫烷硫变化的荧光探针及成像研究

In comparison with other biological detection technologies, fluorescence bioimaging technology has become a powerful supporting tool, which provides an attractive technique to study physiological and pathological processes of interest with high spatial and temporal resolution, less invasiveness, and more convenience. Reactive oxygen species and sulfane sulfur can rapidly respond to each other within mitochondria. To meet this challenge, a strategy with computer assisted molecular dynamics and organic synthesis techniques will be developed to optimize selective recognition receptors for reactive oxygen species and sulfane sulfur. Next we design and synthesize fluorescence probes for multi-species interaction detection that can locate in mitochondria. Via examining the interaction recognition mechanism of reactive oxygen species and sulfane sulfur, we will explore the design strategies of fluorescence probes for interaction multi-species detection. Under cellular or sub-cellular level, perform fluorescence imaging analysis for reactive oxygen species and sulfane sulfur, and investigate their generation, distribution and various concentrations in mitochondria. Complete the in situ dynamic fluorescence imaging analysis on the levels of molecular, cells and in vivo. This project not only has important scientific significance to elucidate the interacted generation mechanism between intracellular ROS and sulfane sulfur, is also expected to further determine whether sulfane sulfur is real signal transduction molecules or not.

荧光探针成像技术以其高时空分辨、操作简便和原位非损伤检测等优点，在生物活性物种检测领域，已成为一种功能强大的研究辅助工具。本项目针对线粒体内活性氧物种与硫烷硫分子可发生迅速交互响应的检测难题，拟借助计算机分子动力学辅助、有机合成等实验技术，优化出对相关活性氧物种和硫烷硫选择性识别的受体，进一步设计合成具有线粒体定位、多物种联动检测功能的荧光探针。通过对活性氧物种和硫烷硫的联动识别机理研究，探索用于联动检测多物种荧光探针分子的设计策略。在细胞甚至亚细胞水平上，对线粒体内活性氧物种和硫烷硫关联浓度进行荧光成像分析，检测活性氧和硫烷硫在线粒体靶位的产生、分布和浓度差异。实现在分子、细胞和活体三个层次上对活性氧物种和硫烷硫进行原位、动态的荧光成像分析。本项目不仅对阐明细胞内活性氧和硫烷硫关联生成机制具有重要的科学意义，还可望为进一步确定硫烷硫是否为真正的信号转导分子奠定理论基础。

1、开发了NIR荧光探针Mito-SeH，用于缺氧胁迫下的活细胞和活体内硫烷硫的检测。利用探针检测了单层细胞，三维多细胞球体中的硫烷硫，以及缺氧小鼠模型的体外解剖器官中硫烷硫的变化。建立小鼠急性缺血模型，评价硫烷硫对缺氧胁迫下ROS生成的抑制作用。结果揭示硫烷硫可以防止活细胞缺氧胁迫下的氧化损伤。.2、开发了近红外荧光探针Mito-SeH，用于缺氧胁迫下的活细胞和活体内硫烷硫的检测。探针灵敏，稳定，生物相容性好，可以对细胞内硫烷硫进行荧光成像。建立小鼠急性缺血模型，评价硫烷硫对缺氧胁迫下ROS生成的抑制作用。所有的结果都揭示硫烷硫可以防止活细胞缺氧胁迫下的氧化损伤。缺氧的保护机制是通过清除线粒体中的ROS通路来抑制半胱天冬酶依赖性凋亡。.3、设计了一系列含有两个双亲电基团的探针用于有效捕捉H2Sn。该系列探针对H2Sn具有高选择性。通过实验还验证了H2S和活性氧物种反应可产生H2Sn，并且胱硫醚γ-裂解酶（CSE）和胱硫醚 β-合成酶（CBS）对H2Sn的产生起着重要的作用。探针还成功地应用于检测活细胞外源性以及内源性的H2Sn，同时还应用于小鼠体内H2Sn的荧光成像。实验中，还检测了小鼠脏器组织（脑、肾、肝、心、肺）匀浆中H2Sn的浓度水平。.4、实验证实H2Sn可以在H2S存在的情况下由活性氧氧化得到，这被认为是在细胞中潜在的H2Sn直接生物合成途径。该线粒体靶向探针也显示出对O2•-/H2Sn检测的高度选择性响应。RAW264.7细胞的荧光共焦显微成像说明该探针可以用于实时原位地研究活性氧物种爆发和H2Sn生成的细胞内过程。利用细胞实验的流式细胞术分析进一步证实了生物成像结果。该系列探针成功应用到检测小鼠体内的O2•-/H2Sn交互响应过程。.5、构建近红外荧光探针Cy-Dise由于检测多硫化半胱氨酸。探针具有较低的细胞毒性，可用于细胞和活体。通过激光共聚焦显微镜定量检测出在人的肝癌细胞、人的正常肝细胞以及小鼠原代肝细胞中Cys-SSH的浓度分别是0.80 ± 0.1 μM、1.85 ± 0.2 μM和2.51 ± 0.4 μM。构建大鼠的原位肝癌模型，通过小动物成像系统验证在正常大鼠和癌症大鼠的肝脏中Cys-SSH的不同。

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