腺苷酸活化蛋白激酶对糖尿病肾脏损害的保护作用及机制研究

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被称为真核生物"细胞能量调节器"，激活的AMPK能够调节糖代谢、细胞增殖及蛋白质的合成。有研究表明高糖环境抑制AMPK活性，使mTOR通道活性增强，继而导致蛋白质合成增加和肾脏肥大。我们的初步研究显示，AMPK高表达和活性增强时能显著减轻糖尿病肾损害。但AMPK抗糖尿病肾脏损伤的作用机制不清楚。本项目将使用重组腺相关病毒（rAAV）载体介导野生型、持续激活型及抑制型AMPKα1基因转染糖尿病肾病大鼠模型，研究AMPK活性对糖尿病肾脏功能、肾脏肥大及细胞外基质沉积的影响和基质成分合成的变化；进一步分别在体外培养的肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞和系膜细胞中研究高糖调节AMPK磷酸化和AMPK抗高糖损害的分子及信号机制。通过本项目研究阐明AMPK防治糖尿病肾损伤的作用及其机制，为糖尿病肾病治疗提供新的靶点。

我们的目的是通过体内外实验研究AMPK对糖尿病肾病的保护作用及其机制。我们发现，高糖作用于肾脏来源的HBZY-1细胞，AMPKα 磷酸化水平呈时间依耐性下降；mTOR信号通路重要分子mTOR、eEF2K、p70s6K和4EBP1磷酸化水平呈时间依赖性升高，蛋白合成通路被激活；细胞外基质分子FN、Col4α1、Col3α1、Col4α5 和 laminin γ1 mRNA水平显著升高，FN和Col4α1蛋白水平显著增加。高糖条件下，给予AMPK的激动剂AICAR，或表达持续性激活AMPK的rAAV2-AMPK-α1-CA，可显著降低FN和Col4α1蛋白表达水平；给予AMPK抑制剂compound C，FN和Col4α1蛋白表达水平则明显升高。表明高糖抑制AMPK活性，可通过mTOR信号通路的活化，使细胞外基质蛋白表达显著升高；通过内、外源性途径活化AMPK 能够显著抑制细胞外基质蛋白FN和Col4α1的表达。此外，我们还发现，高糖能够上调CTGF mRNA的表达，给予AICAR或rAAV2-AMPK-α1-CA，可逆转高糖诱导的CTGF mRNA的表达，用AMPK抑制剂compound C处理后，CTGF mRNA表达与高糖组相比显著升高。表明高糖通过抑制AMPK 表达，诱导CTGF 表达上调，可能影响肾小球系膜细胞基质合成，进而影响肾脏纤维化的发生；通过内、外源性途径恢复AMPK活性，可逆转高糖引起的CTGF上调。在高脂高糖饮食及小剂量STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型中，注射表达持续激活型AMPKα1的rAAV2-AMPK-CA，发现外源性持续激活的AMPKα1可减少糖尿病大鼠肾脏炎症因子及细胞外基质表达，改善肾小球肥大及肾小球系膜扩张，肾小球硬化及肾间质纤维化有所减轻, 参与蛋白质合成的mTOR信号通路显著抑制（mTOR、eEF2K和4EBP1磷酸化水平显著降低）。我们的研究通过体内外实验证实高糖是引起细胞外基质合成的重要因素，AMPK是治疗糖尿病重要靶点，为糖尿病肾病的治疗提供新的方向。

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