Notch-1在肿瘤细胞再黏附中功能与生物力学机制研究

Tumor metastasis and recurrence are the leading causes of death in cancer patients. There are a large number of studies on the recruitment of circulating tumor cells (CTCs) and its effect on the prognosis of patients, but how to CTCs adhesion in the new site and its molecular mechanism are rarely reported. Our preliminary study shown that Notch-1 activation resulted in accelerated adherence to tumor cells and that Notch-1 activation induced the cell membrane to protrude outward under suspension culture conditions to form a number of microtentacles (McTN), which are related with the ability of tumor cells to re-adhesion. In this study, breast cancer cells were suspended culture to mimic the unattached state of circulating tumor cells in vivo. The CRISPR / Cas9 gene editing technique, immunofluorescence, cell membrane labeling and confocal imaging will be used to analysis the role of Notch-1 signaling pathway in the re-adhesion of suspended tumor cells. In addition, the gene expression of the cytoskeleton associated with modification was analyzed to elucidated its regulatory mechanism. This study would clarify the mechanism of tumor metastasis, which may provide a new theoretical basis to cancer therapy.

肿瘤的转移和复发是导致癌症患者死亡的主要原因。目前有大量的研究针对循环肿瘤细胞的募集及其对患者预后效果的影响，然而循环肿瘤细胞如何在新的部位再次黏附的分子机制却鲜有报道。我们的前期研究发现Notch-1活化会导致肿瘤细胞贴壁速度加快，且在悬浮培养条件下，Notch-1活化促使细胞膜向外凸起，形成很多动态的微触角(microtentacle, 简称McTN)，而这些McTN的形成与肿瘤细胞再黏附能力存在一定的相关性。基于此，本项目以乳腺癌为研究对像，拟采用肿瘤细胞悬浮培养方法模拟体内的循环肿瘤细胞未黏附状态，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术、免疫荧光、细胞膜标记和共聚焦成像等手段探讨Notch-1及其信号转导途径在悬浮肿瘤细胞再黏附中的功能与生物学基础，并通过与细胞骨架修饰相关的基因表达分析研究，阐明其调控机制。该研究结果将有助于增进对肿瘤转移机制的认识，为肿瘤治疗提供新的理论依据。

肿瘤转移是肿瘤致死的重要原因，从原发病灶脱落的肿瘤细胞进入循环系统成为循环肿瘤细胞，随血液到达新的组织部位再黏附，形成新的转移灶。对于循环肿瘤细胞再黏附的机制目前并不十分清楚。本研究在乳腺癌细胞MDA-MB-231中发现Notch-1活化在循环肿瘤细胞再黏附中起重要作用，且通过本项目的研究探明其促进细胞再黏附的分子机制为Notch-1活性通过抑制去乙酰化酶HDAC6的表达，降低微管的去乙酰化程度，使微管蛋白α-Tubulin的乙酰化修饰增强，达到促进微管聚合，稳定细胞微管的作用；另一方面，Notch-1活性降低肌球蛋白轻链MRLC的磷酸化水平，使细胞皮层向内的收缩力降低。这两方面的作用平衡，导致循环肿瘤细胞膜向外伸出许多基于细胞骨架的微触角结构McTNs，该结构的数量越多，长度越长，细胞的黏度能力越强，贴壁越快。为证实这一结果，在沉默Notch-1的细胞中，观察到与之相反的结果。且在Notch-1活化的细胞中引入非乙酰化突变体，Notch-1过度活化引起的细胞McTNs增加被拮抗，细胞粘附减弱；而Notch-1沉默细胞引入高乙酰化突变体则McTN增加，细胞粘附增强。同样，MRLC非磷酸化突变体转染细胞、细胞收缩力抑制剂处理细胞也均可逆转Notch-1沉默导致的McTNs减少。.综上，本研究证实Notch-1一方面通过抑制HDAC6表达提高α-Tublin乙酰化水平增加微管稳定性，促进McTNs形成；另一方面，Notch-1通过降低MRLC的磷酸化水平，减少细胞的收缩力，促进微管稳定，增加McTNs的形成。通过促进McTNs形成，促进循环肿瘤细胞的再粘附。

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