反相乳液法制备多酶催化剂及其有机相酶催化过程强化新机制研究

Fabrication of multienzyme catalysts with high stability and high activity in the presence of organic solvents is a prerequisite for an expanded application of enzymatic catalysis in chemical industry . The proposed study aims to establish molecular and process fundamentals for synthesizing multienzyme catalysts used for chemical synthesis in organic media, by conjugation with reactive polymer that forms reverse emulsions in organic solvents. Novel approaches to intensify the catalytic process of the proposed multienzyme catalysts in organic solvents will also be explored. To attain these objectives a comprehensive suite of simulation, multidimensional structural characterization and enzymatic reaction will be established to uncover the interactions among components of enzymatic system in the formation of the emulsion and the subsequent conjugation yielding the expected multienzyme catalysts with a high yield of catalytic activity. In the context of above mentioned reverse emulation using reactive polymer, a new method started by Con A agglutination, followed by conjugation in the polymer emulsion, will also be explored for the synthesis of multienzyme catalysts. The effects of magnetic iron nanoparticles, bovine serum albumin, solid granule and solvent as porogenic agents on the enzyme stability, morphology and structure, mass transport performance and the overall catalytic performance of the enzyme catalysts will be examined, respectively. Enzymatic synthesis of chemicals in organic solvents will be conducted to demonstrate and improve the workability of the proposed multienzyme catalysts. With these we hope to provide theoretical fundamentals and enabling tools for the design, synthesis and application of multienzyme catalysts for chemical synthesis in organic solvents.

构建能够耐受有机溶剂、催化活性高并易于回收的多酶催化剂是拓展酶催化在化学工业中应用的基础和前提。本项目采用反应型高分子替代表面活性剂来形成反相乳液包埋酶分子，进而通过化学反应形成高分子-酶偶联体，利用高分子两亲特性使高分子-酶偶联体分散于有机溶剂中以发挥酶的催化功能。将综合运用分子模拟、多维结构表征及酶反应动力学实验来揭示反相乳液的形成与结构调控机制，优化乳液对酶的包埋以及高分子与酶的交联反应过程；研究并建立Con A凝集酶与反相乳液法相结合制备多酶催化剂的新方法；考察磁性铁纳米颗粒、牛血清白蛋白和致孔剂等对于多酶酶催化剂中酶分子空间分布、酶分子构象及其稳定性、催化剂立体结构、传质行为和表观催化特性的影响机制。通过上述研究建立酶催化剂设计与可控制备的新方法，揭示有机相多酶催化的过程强化新机制，为多酶催化剂的设计、制备及应用于有机相中合成精细化学品提供理论指导和技术支持。

本项目旨在研究多酶催化剂的构建新方法，提高多酶催化剂在应用环境中的稳定性和催化活性。取得的主要成果是：1）提出了一种用嵌段聚醚Pluronic作为交联剂通过反相乳液法制备双酶催化剂的新方法，首先采用过超声形成稳定的油包水胶束将酶包埋在胶束中，再引发将酶的氨基与Pluronic的醛基交联反应。通过荧光共振能量转移实验测得葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的平均距离为6.1 nm。通过在主体溶液中引入过氧化氢酶的竞争反应来研究中间产物过氧化氢的扩散情况，结果显示：在主体溶液中添加过氧化氢酶对上述双酶体系反应影响较小，证明该双酶交联体具有邻近效应，可以将中间产物迅速转化为最终产物。利用Pluronic在有机相中的高溶解度特性，将双酶交联体应用于氧化移除油水两相体系中的苯酚，主要考察了其在二甲基亚砜、甲醇、氯仿中的反应活性，结果表明双酶交联体与自由酶相比具有更高的苯酚去除效率以及优异的重复使用性，重复使用10次后仍具有90%以上的初始活性；2）提出了一种酶交联聚电解质静电自组装形成双酶催化剂的方法，利用高电荷密度的聚电解质可以吸引溶液主体相中带相反电荷的离子如质子或氢氧根离子从而形成具有不同于主体溶液pH的微环境，使得单酶附近的微环境接近其最优反应pH，由此拓宽单酶的pH操作范围，使得一锅法双酶级联反应的pH更容易协调。基于该思路，将氯过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶分别与聚甲基丙烯酸、壳聚糖季铵盐进行共价交联，接着将双酶应用于一锅法催化氧化对二甲苯的反应中，结果表明该固定化方法合成对甲基苯甲酸产物的收率是自由酶的7.6倍。我们还将该方法应用于葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的共固定化中，结果显示在底物浓度较低的条件下这种双酶共固定化结构与自由酶相比表现出更低的米氏常数Km以及更高的表观活性，显示出其在一锅法酶级联反应中的广阔应用前景。

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