深海细菌B5及突变文库活性化合物的二维有序分离及核受体靶点生物学机制研究

In this project, isolation, structural elucidation and molecular mechanism involved in RXR and Nur77 pathway of secondary metabolites from deep-sea Bacillus subtilis B5 and its mutation libraries and some deep sea derived fungi are carried out. By taking the advantages of two-dimensional chromatographic separation techniques, this proposal aims to establish the biological target research platforms for marine drugs or secondary metabolites from deep-sea microorganisms. In order to understand the target molecular mechanism of bioactive molecules and develop new research strategy for natural drug targets, Macrolactins and other secondary metabolites from B5 bacteria via sequencing and mutation analysis will be inverstigated by new approaches for activating silent biogenetic gene clusters in marine microorganisms. It will also help to develop new methods to evaluate the molecular mechanism of marine drugs and build the theoretical basis of lead compound discovery and exploiation, by using modern molecular pharmacology.

课题选择可产生活性次生代谢产物，代谢产物具有一定结构特点，并完成全基因组测序的几株深海微生物为研究对象，开展以核受体为靶点的先导化合物发现、形成规律及作用机制的研究。本课题以深海细菌B5为主要研究对象，以24碳大环内酯类化合物为参照物，以二维制备色谱有序分离为手段，针对B5沉默基因激活和等离子突变文库，从基因水平上开展新化合物的发现、生物合成途径阐述、核受体靶点生物学机制研究和合成生物学元件探索等工作，力求在发展天然药物化学研究方法、探索天然产物形成规律方面取得一些进展，为先导化合物的发现与研究奠定基础。

课题以深海微生物为资源，开展发现以核受体等为靶点的活性分子研究工作。主要研究成果如下：1）对B5等菌株仿深海条件，高压低温发酵，乙酸乙酯提取，采用硅胶柱色谱层析、薄层层析、中压反相ODS柱层析、HPLC柱色谱层析等色谱方法进行代谢物的分离纯化，并结构表征。2）对B5及其部分突变株等十株菌株大发酵，乙酸乙酯提取，采用硅胶柱色谱层析、薄层层析、中压反相ODS柱层析、HPLC柱色谱层析等色谱方法进行代谢物的分离纯化，质谱检测和核磁共振测试等方法进行结构鉴定，总共得到59个化合物，其中新化合物10个。3）基于新型在线二维分离系统运用于目标菌株次级代谢产物的分离,包括不同环境来源的一株细菌和五株真菌发酵物的乙酸乙酯提取物。从分析放大到制备,共得到 114 个化合物,包括 22 个新化合物。从土曲霉属H768进行发酵分离纯化，得到24个化合物。自红树林棘孢木霉H553，分离鉴定到 23个单体化合物，其中得到3个新化合物。4）以核受体 RXRα 、Nur77、CDK9和CDK1 为靶点，利用计算机辅助药物设计，分别设计合成了286个化合物。基于最新的蛋白降解靶向联合体 (PROTAC)，课题以 ICDK9 为功能分子，设计合成20多个小分子探针，其中12-10 进行诱导靶向蛋白降解实验研究。实验结果显示，12-10 可以在纳摩尔浓度下通过 CRBN 依赖的途径特异性地降解 CDK9。实验中通过进一步结合 SILAC 定量蛋白组学技术，鉴定出了那些显著下调的蛋白，从中成功地筛选到 ICDK9 未见报道的新的结合靶点 RXRα。经 ITC 及报告基因验证，ICDK9 在体外能与RXRα-LBD 结合，并诱导 RXRα 的转录激活。PROTAC 技术和靶向 RXRα、Nur77、CDK9和CDK1 的化合物的发现和作用机制研究对新靶点的阐述具有重要意义。

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