进食上调胆固醇合成的分子机制研究

Cholesterol is an essential component of most biological membranes and is the precursor for synthesis of steroid hormones and bile acids. However, high level of blood cholesterol is a major risk factor of atherosclerosis. The de novo biosynthesis of cholesterol is tightly regulated in mammalian cells. HMGCR catalyzes the conversion of HMG-CoA to mevalonate that is a rate-limiting step in cholesterol biosynthesis. As HMGCR is one of major checkpoints in cholesterol biosynthesis, sterol promotes the rapid degradation of HMGCR through the ubiquitin-proteasome pathway, and therefore slows down cholesterol biosynthesis. Our previous studies have found that HMGCR protein in liver showed dramatically increased levels when mice were refed and HMGCR is stabilized by interacting with a deubiquitinating enzyme (DUB). We performed a screen for the DUB involved in the sterol-regulated degradation of HMGCR pathway and found USPH remarkably stabilizes HMGCR protein. Because expression of USPH protein was mainly confined to the liver, we generated mice with liver-specific deletion of USPH (L-Usph−/− mice). The results showed that ablation of USPH in liver markedly blocked HMGCR protein accumulation induced by refeeding. In this proposal, we will explore the role of USPH in the regulation of endogenous cholesterol synthesis. The working mechanism of USPH will be investigated. We will also elucidate the signaling pathways in USPH activity regulation and nutrient sensing mechanism, and illustrate its physiological significance in energy homeostasis.

胆固醇是哺乳动物不可缺少的脂质分子，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、甾体激素的原料，但胆固醇代谢异常可导致心血管疾病，所以胆固醇的合成受严格调控。已知胆固醇合成途径限速酶HMGCR 蛋白的稳定性受体内甾醇水平控制，高水平甾醇促使HMGCR蛋白结合泛素连接酶gp78，被后者泛素化修饰后降解。我们前期研究发现HMGCR蛋白在饥饿-再进食后显著上调，蛋白质去泛素化修饰在其中起主要作用。进而我们筛选得到HMGCR特异的去泛素酶USPH，USPH在肝脏中高表达，USPH肝脏特异敲除的小鼠在饥饿-再进食后HMGCR蛋白不能被诱导，血清中胆固醇及甘油三脂水平显著降低。在本项目中，我们将深入探讨USPH在内源胆固醇合成调控中的作用，探索其作用的分子机制，明确USPH活性调控机制和营养感知响应的信号通路，阐明其在能量稳态中的生理意义及在高脂血症和动脉粥样硬化发生中的病理作用。

胆固醇是哺乳动物必不可少的脂质。胆固醇代谢异常会引起一系列的代谢性疾病，如心血管疾病，肥胖病，脂肪肝等，因此胆固醇的合成受严格精密调控。已知哺乳动物仅在进食后才增加胆固醇生物合成，并在饥饿时抑制其进程。但是，对饥饿--再进食过程中胆固醇生物合成的调控机制仍了解甚少。我们发现进食诱导后，相对于其它胆固醇合成酶，仅胆固醇合成限速酶HMGCR蛋白表达显著增加，并且蛋白翻译后修饰在其中发挥了最主要的作用。我们通过分离饥饿或再进食小鼠肝脏的胞浆组分，进行体外泛素化和去泛素化实验，确定再进食后HMGCR被去泛素化修饰。我们从74个去泛素化酶库中筛选到USP20是HMGCR特异的去泛素化酶。组织表达谱显示USP20在肝脏中高表达。我们构建了肝脏特异性敲除USP20的小鼠（L-Usp20-/-），敲除小鼠肝脏中HMGCR不再受进食诱导升高，进食后肝脏中胆固醇合成速率相对于野生型小鼠（WT）显著降低。进一步的机制研究表明，葡萄糖和胰岛素信号通路可激活USP20的活性，通过定量质谱分析鉴定出USP20的S132和S134位点在葡萄糖和胰岛素刺激后被磷酸化修饰。我们发现USP20的S132 / S134磷酸化促进其结合到gp78，进而作用于HMGCR。体外磷酸化实验显示mTORC1是USP20特异的蛋白激酶。我们构建了USP20（S132A / S134A）点突变小鼠（Usp20KI/KI），再进食后，Usp20KI/KI肝脏中HMGCR蛋白量相对于WT小鼠显著降低。我们用USP20抑制剂GSK2643943A灌胃处理小鼠，USP20抑制剂在饥饿和再进食条件下均显著降低了血清中胆固醇和甘油三酯的水平。综上，我们发现进食后葡萄糖和胰岛素信号激活mTORC1，mTORC1磷酸化USP20进而去泛素化修饰HMGCR，HMGCR蛋白增加，促进胆固醇合成。并证明USP20是一种潜在的药物靶点，可用于治疗包括高脂血症，肥胖症和糖尿病等代谢疾病。该发现揭示了胆固醇合成过程中营养感知与应答的信号通路，加深我们对胆固醇代谢动态调控以及体内能量稳态调控机制的理解，并阐明了胆固醇合成对能量代谢的生理病理意义。

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