DRC1基因突变导致精子鞭毛多发形态异常的致病机制研究

Multiple morphological abnormalities of the sperm flagella (MMAF) is a rare asthenoteratozoospermia characterized by the short, absent, coiled and/or bent flagella, which can cause male infertility with severely impaired sperm motility. Recently, the applicant performed whole exome sequencing in a cohort of 39 MMAF patients and found two homozygous nonsense mutations in a new MMAF candidate gene: DRC1. Sanger sequencing and functional analysis confirmed the pathogenicity of the mutations. In addition, immunoprecipitation revealed the interaction between DRC1, DRC2, DRC3, and DRC4 in vitro cell lines. Using CRISPR/Cas9 technology, we plan to generate Drc1 KO mice to confirm the relationship of DRC1 mutations and MMAF syndrome. Furthermore, we plan to use Drc1 KO mice, human testicular tissue and various cell lines to explore and confirm the DRC1 interacting protein by proteomic analysis, immunoprecipitation, etc. The findings of this study might elucidate the pathogenic mechanism of DRC1 mutations in MMAF and provide additional knowledge for genetic diagnosis of male infertility.

精子鞭毛多发性形态异常（MMAF）是一种由于精子鞭毛变短、缺失、卷曲或弯折等形态异常而造成精子运动障碍，导致男性不育的罕见畸形精子症。申请人前期对39例MMAF患者行全外显子组测序分析，鉴定出MMAF新的候选致病基因DRC1的2个纯合无义突变。Sanger测序和功能实验证实了该突变的致病性，此外我们还在体外细胞系中通过共转染标签质粒联合免疫共沉淀的方法发现DRC1与DRC2、DRC3及DRC4间存在相互作用关系。本研究拟采用CRISPR/Cas9技术构建Drc1基因敲除小鼠模型，验证DRC1基因突变与MMAF之间的相关性，并利用人睾丸组织、体外细胞系等通过蛋白质组分析、免疫沉淀等方法寻找DRC1相互作用蛋白，揭示DRC1在精子发生和形态维持中的作用及其调控网络，阐明DRC1基因突变导致MMAF的致病机制，为男性不育精确诊疗提供理论依据。

研究背景：近年来，我国不孕不育的发病率从9%增长至18%，而其中约一半因素来源于男性。畸形精子症是导致男性不育的主要因素之一，其中包括精子鞭毛多发形态异常等（multiple morphological abnormalities of the sperm flagella, MMAF）。动纤毛/鞭毛缺陷可导致原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia, PCD），这是一种多系统遗传疾病，不育症是其主要临床表型之一，其发病率约为万分之一。连接蛋白-动力蛋白调节复合物（nexin-dynein regulatory complex, N-DRC）连接鞭毛内相邻的二联微管，起到稳定鞭毛结构，调节鞭毛运动的功能。在衣藻的研究中DRC1、DRC2、DRC4被认为是N-DRC的核心组分。近年来有报道发现DRC1突变会导致患者出现PCD表现，但迄今为止，仍未有Drc1敲除小鼠模型研究其在哺乳动物中的功能。. 方法及结果：通过全外显子组测序，我在2例MMAF患者中筛选到DRC1基因两个纯合功能缺失性突变位点。患者主要表现为男性不育，并不伴有PCD症状。我们构建了Drc1-/-、Drc1R554X/R554X和Drc1W244X/W244X突变小鼠。突变小鼠同样表现以MMAF为特征的雄性不育。通过Co-IP，我们发现DRC1与DRC2、DRC3、DRC4和DRC5均存在相互作用，证明DRC1是纤毛和鞭毛中N-DRC组装的关键组分。此外DRC1缺失的精子鞭毛轴丝中除了N-DRC结构的丧失外，还表现出放射辐，动力蛋白臂等结构的丢失。我们发现在精子鞭毛的形成过程，DRC1的缺失虽然不影响精子细胞早期的轴丝组装，但随着精子变形过程的进行，轴丝内部微管出现紊乱，最终导致鞭毛轴丝的发生异常。这些结果进一步表明DRC1在调节精子鞭毛轴丝的结构稳定性中起关键作用。同时轴丝微管结构紊乱，也导致精子核周颈带微管结构动态变化异常，进而导致较高比例的精子头部畸形。. 研究结论：本研究发现了人类MMAF新的致病基因DRC1，并揭示了N-DRC核心组分DRC1在哺乳动物精子鞭毛轴丝组装中的重要功能。小鼠Drc1基因缺陷可导致呼吸道纤毛缩短及运动功能受损，也导致精子鞭毛轴丝结构紊乱和运动功能障碍。上述研究结论为未来研究鞭毛和纤毛结构稳定性提供了

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