新型断裂蛋白质内含子及其应用的研究

断裂蛋白质内含子及其蛋白质反式剪接是近十年来兴起的一个有重要应用前景的研究新领域。生物基因组中天然断裂蛋白质内含子（S0型）极其少见，通过基因工程的方法可以人工获得。但S0型断裂蛋白质内含子的应用有局限性。本项目将构建和筛选多个高剪接活性的、相互之间无交叉反应并对相邻氨基酸无偏好性的S1型、S2型和S11型断裂蛋白质内含子。利用这些新型断裂蛋白内含子对重组蛋白质进行位点特异性的N端或C端标记，标记物可为荧光素或生物素等，建立一种蛋白质标记新技术。该技术解决了传统化学方法标记蛋白质的非特异性、产物不均一性等缺点。利用随机突变、加上功能选择，以其达到定向进化，来获取蛋白质工程中通用和高剪接活性的蛋白质内含子。新型断裂蛋白质内含子的研究也将有利于探索蛋白内含子结构与功能的关系。

在项目执行过程中，取得了如下成果：1）测试、获得了多组高剪接活性、相互之间无交叉反应并对相邻氨基酸无偏好性的断裂蛋白质内含子。2）选用KanR作为微小蛋白质内含子定向进化的筛选系统，采用随机突变、功能选择、定向进化，优化了我们已经获得的微小蛋白质内含子Cne PRP8，通过六轮随机突变，不断积累有益突变，定向进化了Cne PRP8蛋白质内含子，最终获得剪接效率高、通用性好的Cne PRP8蛋白质内含子（CPE）。3）建立了一种蛋白质标记新技术，即通过蛋白质反式剪接技术，将荧光素成功地标记到重组蛋白质的特异性位点；我们对三种蛋白质MBP、GST和SUMO的N端和C端成功地进行了荧光素标记；我们同时选择ERp44蛋白质，对其C端成功地进行了荧光素标记。4）研究了蛋白质反式剪接的机理，对蛋白质剪接位点的氨基酸偏好性进行比较系统的研究。5）研究了基于断裂蛋白质内含子的蛋白质纯化机理，并且建立了蛋白质纯化新的系统。6）借助两种断裂型蛋白质内含子（S0和S1型）和Zn离子敏感型的蛋白质内含子成功解决了蛋白质内含子体内断裂的难题；通过对蛋白质内含子首位氨基酸进行突变，筛选得到一例以Gly为起始的突变型蛋白质内含子，成功解决了蛋白质内含子对目的蛋白断裂的偏好性；将蛋白质内含子应用于生物传感器，研究了6个临床发现的在甲状腺激素配体结合区域中引起耐甲状腺激素病症 (Resistance to thyroid hormone)的突变对甲状腺激素与其受体结合的影响。7）利用建立的高剪接活性的蛋白质剪接系统，我们合成了蜘蛛丝蛋白质，并且研究了合成的蜘蛛丝蛋白质的表达、蛋白质的一级及高级结构与丝纤维性能的关系、成丝机理等。8）项目发表研究论文25篇，其中SCI收录论文9篇，2区论文8篇；9）培养毕业博士研究生4名、硕士研究生11名。

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