长链非编码RNA-NCRNA00173参与小细胞肺癌耐药的机制研究

Our previous study has demonstrated that long non-coding RNA (lncRNA) NCRNA00173 is closely associated with the chemoresistance of small cell lung cancer (SCLC). NCRNA00173 may function as competing endogenous RNAs (ceRNAs) in modulating SCLC drug resistance. To further investigate the molecular mechanism of NCRNA00173 in regulating chemoresistance of SCLC, we intends to use two different cell models of SCLC resistant cells to carry out the following studies: (1) To clarify the effect of NCRNA00173 on cell sensitivity to chemotherapeutic drugs in vitro and in vivo; (2) Using luciferase experiment to verify the miR-495/miR-218 can directly target NCRNA00173 and Etk/Bmx; (3) To analyze the effect of both miR-495/miR-218 and NCRNA00173 on Etk/Bmx expression; (4) Using RIP technology to analyze the role of NCRNA00173 on Etk/Bmx expression through miR-495/miR-218; (5) To analyze the effect of miR-495 methylation status on LINC00173 expression; (5) To analyze the clinical significance of NCRNA00173 expression and its relationsip with miR-495/miR-218 and Etk/Bmx in SCLC tissues. The molecular mechanism of SCLC chemoresistance will be further enriched through this research project.

我们前期发现长链非编码RNA-NCRNA00173与小细胞肺癌耐药关系密切，并可能作为一种竞争性内源RNA，参与小细胞肺癌耐药的调节。为进一步明确NCRNA00173在小细胞肺癌耐药中的作用及机制，本课题拟利用已有耐药细胞模型开展以下研究：（1）体外和体内实验分析NCRNA00173对细胞药物敏感性的影响；（2）荧光素酶实验验证miR-495/miR-218靶向作用NCRNA00173和Etk/BMX；（3）下调或上调NCRNA00173表达，同时增加或降低miR-495/miR-218，分析对Etk/BMX表达的影响；（4）RIP实验明确NCRNA00173通过miR-495/miR-218调节Etk/BMX表达；（5）分析NCRNA00173在小细胞肺癌组织中表达的临床意义及与miR-495/miR-218及Etk/BMX的相关性。通过本项目研究，进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制。

阐明小细胞肺癌化疗抗药性的分子机制已成为当今肺癌临床治疗学的重要研究课题之一。课题组前期发现长链非编码Linc00173（NCRNA00173）与小细胞肺癌化疗耐药关系密切。本课题利用小细胞肺癌患者临床标本、耐药细胞模型（H69AR和H446AR）及动物模型（裸鼠移植瘤和PDX），采用细胞生物学和分子生物学技术，进一步明确Linc00173在小细胞肺癌耐药中的作用及分子机制。主要研究发现（1）Linc00173在小细胞肺癌患者肿瘤组织及外周血的高表达与患者的化疗药物敏感性、肿瘤分期以及不良预后密切相关；（2）Linc00173表达与小细胞肺癌细胞耐药、增殖、迁徙、体内成瘤等密切相关。沉默Linc00173可显著增加细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性、迁移和侵袭能力、以及体内成瘤能力降低；反之，增加Linc00173表达，显著降低细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性、迁移和侵袭能力、以及体内成瘤能力增强。（3）荧光素酶实验和RNA干扰实验验证miR-218可能同时调控Linc00173及Etk；RIP实验证实miR-218通过结合Ago2调控Etk mRNA水平的降解，而Linc00173竞争性结合miR-218的RISC复合物，从而正向调控Etk表达；RNA-pulldown实验进一步证实了Linc00173结合RISC沉默复合物。结果表明Linc00173通过竞争性结合miR-218调控Etk表达。（4）干扰下调Etk表达，GSKIP和NDRG1表达随之下降，上调Etk表达，GSKIP和NDRG1表达也随之增加；对裸鼠成瘤组织进行免疫组化分析，结果也证明Linc00173、Etk与GSKIP和NDRG1存在调控关系；免疫荧光显示上调Etk和Linc00173或下调miR-218可促进β-catenin入核，反之，β-catenin核内聚集减少。（5）依鲁替尼能够明显降低Etk以及pEtk的表达，阻止Etk活化，对小细胞肺癌耐药细胞具有明显辅助提升化疗敏感性，依鲁替尼与化疗药物联用可更有效地抑制肿瘤生长。通过本项目研究，进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制，为下一步开展基于Linc00173逆转小细胞肺癌耐药，以及依鲁替尼联合化疗药物治疗小细胞肺癌耐药患者的研究提供实验依据。

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