CircRNA-Nalcn内源性竞争miR-223-3p上调靶基因Hsp90b1通过调控Akt通路抑制脊髓损伤诱导的脊髓神经元凋亡的作用机制研究

Spinal cord injury(SCI) is a serious deformitive disease which usually brings permanent nerve damage and huge social and personal burdens. It’s a very critical treatment strategy to prevent the progression of secondary injury after spinal cord injury because primary damage cannot be avoided. Neuronal apoptosis is an important initiating factor in the mechanism of secondary injury. CircRNA is a newly discovered class of non-coding RNA involved in the regulation of a wide range of physiological activities and pathological changes. However, the mechanism of circRNA to regulate the neuronal apoptosis is not yet clear. On the basis of preliminary establishment of SCI rat model, cell model, TUNEL assay, flow cytometry, circRNA microarray screening, RT-qPCR and bioinformatics analysis, in vivo and in vitro we intend to clarify:1) the relationship between the expression changes of circNalcn, miR-223-3p, Hsp90b1 and the SCI-induced apoptosis of spinal cord neurons; 2) the molecular mechanism that circNalcn inhibits miR-223-3p as a competitive endogenous RNA; 3) circNalcn inhibits SCI-induced apoptosis of spinal neurons through modulating miR-223-3p/ Hsp90b1/Akt signaling pathway. We hope our work will provide a new theoretical basis to reveal the molecular mechanism of SCI-induced spinal neuronal apoptosis, which is expected to provide a new therapeutic strategy based on circNalcn.

脊髓损伤（SCI）是一种严重致残性疾病，早期治疗策略中阻止继发性损伤十分关键，其中抑制神经元凋亡是重要的干预目标。CircRNA是一类新发现的非编码类RNA，调节广泛的生理活动和病理变化，但目前尚未明确circRNA是否参与调控SCI诱导的脊髓神经元凋亡及潜在的作用机制。本课题在前期建立SCI大鼠模型、细胞模型，进行凋亡检测、基因芯片筛选、PCR验证、生物信息学分析的基础上拟明确：1）circNalcn、miR-223-3p、Hsp90b1基因表达水平与SCI诱导的脊髓神经元凋亡之间的关系；2）circNalcn内源性竞争miR-223-3p的分子机制；3）circNalcn抑制miR-223-3p上调靶基因Hsp90b1通过调控Akt通路抑制SCI诱导的脊髓神经元凋亡的作用机制。希望为揭示SCI诱导的脊髓神经元凋亡的分子机制提供新的理论依据，从而提供基于circNalcn的新的治疗策略。

脊髓损伤（SCI）是一种严重致残性疾病，早期治疗策略中阻止继发性损伤十分关键，其中抑制神经元凋亡是重要的干预目标。我们在脊髓撞击伤大鼠中利用高通量基因芯片筛选、PCR验证，生物信息学进行预测。我们利用生物信息学、双萤光素酶报告基因挑选目的基因。在活体中鞘内注射过表达AAV，在细胞中利用慢病毒构建稳转株，采用PCR、免疫荧光、尼氏染色、蛋白印迹、细胞活性、流式细胞、tunel染色，来验证目标circRNA的过表达对于SCI诱导的继发性运动神经元凋亡、PC12细胞的凋亡的调控作用。通过免疫荧光及尼氏染色观察脊髓前角运动神经元的数量、活性，进行影像学扫描、生物素葡聚糖胺示踪染色观察其轴突变性的情况。我们利用旷场实验、步态分析评估不同时间点大鼠的行为学。结果发现损伤3天后，大鼠脊髓组织中共1676个circRNA出现了差异表达，我们筛选出5个circRNA，其中rno-circRNA-013017（目的基因）的过表达可有效地抑制损伤处头尾相邻节段中点的脊髓前角运动神经元的凋亡，保留更多的脊髓前角运动神经元数量及其活性，同时凋亡相关蛋白也被调控。细胞实验中，目的基因过表达可减少细胞毒性、增加细胞活性、抑制细胞凋亡，同时凋亡相关蛋白也被调控。我们发现SCI6周时，干预组脊髓前角运动神经元的数量和活性是最高的。干预组脊髓白质的FA值升高，ADC值升高。干预组损伤区域的脊髓下行轴突（主要为皮质脊髓束）数量和密度是最高的。行为学显示，干预组的BBB评分要最优。损伤6w时的步态分析显示干预组大鼠步态参数最接近正常。这说明目的基因可抑制SCI诱导的脊髓前角运动神经元的凋亡、H2O2处理后PC12细胞的凋亡并可抑制SCI诱导的脊髓下行轴突（主要为皮质脊髓束）变性，可促进SCI大鼠的双下肢运功功能的恢复，改善大鼠步态，这为恢复SCI患者运动功能提供了新的研究方向和可能。

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