酸性磷酸酶底物识别机制及其磷酸化功能强化的研究

Acid phosphatase is a kind of bidirectional enzyme which can catalyze the production of phosphoric acid monoester and reversibly catalyze the hydrolysis of phosphate monoester to release phosphate group. Its bi-directional catalytic characteristics lie in the nonspecific binding of acid phosphatase and substrate molecules. However, it is unclear on the molecular mechanism of how acid phosphatase recognizes the substrate. In this project, an acid phosphatase originated from Pseudomonas aeruginosa (PaAPase) is expressed in the recombinant Escherichia coli as the research model. Firstly, the crystal structures of PaAPase and PaAPase-substrate are prepared and analyzed. Seccondly, the structure differences of PaAPase binding with different substrates are compared by computer simulation and the substrate recognition model is established. Then, the active site and the substrate binding site of PaAPase are determined, and the key amino acids that determine the substrate recognition are obtained. Finally, phosphorylation and hydrolysis function of PaAPase are revealed. On this basis, a molecular modification strategy is proposed to enhance the phosphorylation function of PaAPase. The results can help to increase the understanding of the structure and function of acid phosphatase, and also provide a new method for the rational modification of other members of the acid phosphatase family.

酸性磷酸酶是一类可同时催化磷酸单酯生成、又可逆地催化磷酸单酯水解释放磷酸基团的双向酶，其双向催化特性的本质在于酸性磷酸酶与底物分子的非特异性结合。然而，酸性磷酸酶如何识别底物的分子机制尚缺乏全局性的认识。本项目以来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的酸性磷酸酶为研究模型，通过解析酸性磷酸酶与不同底物结合的晶体结构特征，建立底物识别模型，解析酸性磷酸酶在识别不同底物过程中活性中心构象动力学和结构域的变化及其关键影响因素，揭示酸性磷酸酶磷酸化功能和水解功能的分子机制，在此基础上提出增强磷酸化功能的分子改造策略。研究结果有助于增加对酸性磷酸酶结构与功能的认识，也为酸性磷酸酶家族其他成员的理性改造提供了新方法。

磷酸化可以赋予有机化合物独特的特性（如化学稳定性、生物降解性、乳液分散性和抗静电性），因此被广泛应用于化学合成、饲料、化妆品和制药等领域。酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)可以利用廉价的磷酸盐供体，如焦磷酸盐(PPi)或聚磷酸盐，催化磷酸化反应，并具有广泛的底物谱，是极具潜力的磷酸化工具。在本研究中，我们重组表达了来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的酸性磷酸酶PaAPase，解析了晶体结构，研究了其催化机制，并通过调节活性位点的局部电场筛选获得最优突变体，提高了该酶磷酸化L-抗坏血酸(维生素C)的能力。主要研究结果如下：.（1）获取并解析了PaAPase的晶体结构。在20°C条件下，对PaAPase进行结晶实验，结晶试剂最终筛选为0.1 M BIS-TRIS（pH 6.5）, 50%聚丙烯乙二醇400（PPG 400）（W/V），通过硒代蛋氨酸（Se-Met）衍生物进行X射线收集晶体衍射数据。结果表明尽管序列相似度低于30%，PaAPase与已报道的其他酸性磷酸酶结构十分相似。.（2）基于经典力学和量子力学的QM/MM组合方法计算解析了PaAPase的催化机制。在PaAPase中His171的Nε亲核进攻焦磷酸（PPi）的P原子，在质子化的His132帮助下促使PPi裂解以及His171的磷酸化。随后，促使磷酸基团从His171转移到维生素C，形成产物维生素C磷酸酯，或磷酸化的His171被水解形成无机磷酸盐。.（3）通过调节活性位点的局部电场工程化策略对PaAPase进行分子改造，获得了对维生素C磷酸化能力大幅提升的突变体。本研究在活性位点附近引入了一系列带电残基，以探索局部电场对PaAPase催化活性的影响，最终获得性能得到较大提升的突变体Q6。Q6的磷酸化/水解酶活比（rt / rh）相对于WT增加了291.1%。在最佳条件下( 88 g/L AsA、189.6 g/L 十水焦磷酸钠、15 g/L 全细胞、pH 4.0、25°C、24 h]，AsA2P 的最高产量达到90.1 g/L，转化率为70.6%，时空产率为3.7 g/L/h（STY）。

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