源于油茶蒲提取物中高效5α-还原酶抑制剂关键化合物的鉴定及对良性前列腺增生的作用机理

Testosterone is metabolized by the enzyme testosterone (T) 5α-reductase to active androgen dihydrotestosterone (DHT). If 5α-reductase expresses abnormally, DHT will gather in the related tissues, and causes benign prostatic hyperplasia (BPH). The efficient 5α-reductase inhibitors have the potential to be the future treatment drug of BPH. We have proven that oiltea camellia extracts (OCE ) is an efficient inhibitor of 5α-reductase and has an effect as potent as Finasteride on BPH. Based on these experimental results, this project focuses on the separation /identification of the key compounds of OCE as efficient 5α-reductase inhibitors. The biochemical /molecular biological methods will be applied to study the on kinetics/dose-effect relationship/ structure activity relationship/target activity of key compounds of OCE on 5α-reductase at the level of molecular and gene in order to clarify the mechanism of action on 5α-reductase. Meanwhile, research will be done to find out the mechanism of action of OCE on BPH and the regulative role of OCE on related genes through animal tests and gene chips technique. The results will provide a totally new 5α-reductase inhibitor and drug of BPH, at the same time to provide theoretical ground for the development of natural health care products on BPH and for the efficient utilization of OCE byproduct.

5α-还原酶能催化雄激素睾酮（T）转变为活性更强的双氢睾酮（DHT），5α-还原酶异常表达将会导致组织中DHT积聚，从而会引起良性前列腺增生（BPH），因此高效5α-还原酶抑制剂的研究已成为预防及治疗BPH的靶点。申请者前期实验结果表明油茶蒲提取物（OCE）为高效5α-还原酶抑制剂并且对于大鼠BPH的改善作用和对DHT诱导的大鼠BPH有显著地改善作用。本项目在已有研究成果基础上，以OCE为试材，拟对其高效5α-还原酶抑制的关键化合物进行分离鉴定，运用生物化学、分子生物学方法，从分子水平上探索关键化合物抑制5α-还原酶的动力学、量效、构效关系及抑制靶向性，明确OCE抑制5α-还原酶作用机理。同时采用动物实验和基因芯片技术，探索OCE对BPH作用机理及对相关基因表达的调控作用。研究成果有望得到一种新型5α-还原酶高效抑制剂，并为改善BPH天然植物保健品的开发和油茶副产物的高效利用提供理论基础。

本项目从具有高5α-还原酶抑制活性的OCE的聚酰胺组分Fr8中分离得到单体，采用人前列腺上皮增生细胞（BPH-1）模型和人前列腺癌细胞（PC-3）模型研究活性单体对细胞的增殖抑制作用，进一步通过高通量荧光定量PCR研究其作用于BPH-1细胞的机理，并运用细胞划痕实验检测其对癌细胞PC-3迁移能力的影响，从而综合评价油茶蒲活性单体所具有的改善前列腺疾病的功能。主要研究结果如下：.（1）采用固相萃取（SPE）和高效制备液相色谱技术（preparative HPLC）从油茶蒲聚酰胺组分Fr8中分离制备得到单体，采用质谱、核磁共振等手段，对3个具有高BPH-1细胞增殖抑制活性的单体进行了结构鉴定。结果表明：3个单体分别为3-O-没食子酰基-4,6-[(S)-六羟基联苯二酰基]-α/β-D-吡喃葡萄糖（gemin D）、3,4,6-三-O-没食子酰基-α/β-D-吡喃葡萄糖（GAG）、橡椀酸双内酯（VAD）。这三种物质均首次在油茶蒲中分离得到。.（2）采用Annexin V/PI双染色法测定了活性单体对BPH-1细胞凋亡的诱导作用。结果表明：试样浓度为50μg/mL ~200 μg/mL、作用时间为48 h时，gemin D、GAG和VAD均能诱导BPH-1细胞凋亡，在同一浓度下各单体诱导BPH-1细胞凋亡活性的强弱依次为VAD＞gemin D＞GAG。.（3）采用高通量荧光定量PCR检测了活性单体作用于BPH-1细胞后与BPH相关基因的变化。结果表明：gemin D、GAG和VAD均能通过显著下调BPH-1细胞中原癌基因C-MYC的表达以抑制细胞增殖，同时显著下调炎症功能通路环氧合酶/脂氧合酶（COX/LOX）中PTGS2（编码COX-2蛋白）、ALOX5（编码5-LOX蛋白）基因的表达，揭示了活性单体在BPH-1细胞中具有良好的抗炎作用（p＜0.05）。.（4）采用体外PC-3细胞模型研究了活性单体对PC-3细胞的作用效果，结果表明：油茶蒲活性单体能抑制PC-3细胞增殖和诱导细胞凋亡。在同一浓度下各单体诱导PC-3细胞凋亡活性的强弱依次为VAD＞gemin D＞GAG。.从油茶蒲中分离得到的3种单体gemin D、GAG和VAD均能在细胞水平上改善前列腺增生和前列腺癌症，且具有抗炎作用，这对于研究和开发预防和治疗前列腺疾病的药物有重要参考价值。

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