血浆ctDNA-NGS用于研究基因变异在中国人非小细胞肺癌发生和转移过程中的推动作用

Gene variation plays an important role in driving tumorigenesis and progression. The presentation of gene variation is in a given pattern, which implies important significances for early detection, molecular classification, warning metastasis and guiding treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC). Circulating tumor DNA (ctDNA) and next generation sequencing (NGS) make it flexible to understand the panorama of gene variation. In the previous study, we have confirmed this characteristic pattern of gene variation in NSCLC, which was detectable by sensitive NGS. In the present study, we will establish a new NGS technique based on targeted sequencing strategy to detect variations of 310 genes, which involved in occurrence and development of NSCLC, in the ctDNA of the different stage NSCLC patients. Gene variation will be screened via DNA sequence alignment between ctDNA and autologous white blood cell DNA (WBC-DNA). Moreover, we will analyze the relationship between the gene variation and clinical data in different development stages of NSCLC, focusing on tumorigenesis and metastasis. Our research explores the feasibility for NSCLC early diagnosis, metastasis predication by using gene variation integral model, and the underlying role of gene variation in driving tumorigenesis and progression, providing a new insight in early diagnosis, predication and prevention of metastasis in NSCLC.

在肺癌发生、发展过程中，基因变异发挥重要的驱动作用，基因变异的出现呈现一定的模式和规律，了解这一规律对肺癌早期诊断、分子分型、转移预警和指导治疗等都具有重要意义。循环肿瘤DNA（ctDNA）及二代基因测序技术（NGS）为“全景式”了解该规律提供了可行性。我们已初步证实了ctDNA中包含有肺癌特征性的基因变异，NGS可敏感地将其检出。本研究拟建立基于靶向重测序策略的NGS技术，用其检测不同分期的非小细胞肺癌（NSCLC）患者ctDNA中310个肺癌相关靶基因序列，通过与自体白细胞DNA序列比对筛选出基因变异，分析不同发展阶段的基因变异规律与临床大数据的关系，侧重于NSCLC发生和转移两个时间节点，探讨通过基因变异积分模型诊断NSCLC以及利用基因变异预警转移的可行性，有助于明确基因变异在推动NSCLC发生发展中所起的作用，为NSCLC早期诊断、转移预警和预防等提供新的思路。

cfDNA不受肿瘤异质性的困扰，包含肿瘤全部遗传信息。此外以体液为检测标本，标本取材便捷且可以在肿瘤发生发展的任何阶段进行取材，可以多次重复的检测以描绘肿瘤突变动态图谱，为靶向治疗前及治疗过程中基因突变全程监测提供唯一的机会。本项目依托我国丰富的病例资源和人群遗传资源优势，通过大样本量的临床病例统计学分析，以及以血液检测为基础对非小细胞肺癌患者cfDNA进行大范围的高通量NGS分析，筛选出能够用于指导靶向治疗的热点基因突变及其突变组合，取得以下成果:①建立基于靶向重测序策略NGS测序技术：通过TCGA 数据库和PUBMED 文献检索，筛选确定参与肺癌发生发展的基因变异密切相关171个基因，并基于安捷伦SureSelect捕获技术，对这171个肺癌特异性相关基因进行探针设计，形成捕获panel。研究证明此项技术探针质量、测序深度、敏感性、特异性等均能满足研究要求；②肺癌驱动基因变异规律及其诊断可行性研究：本研究共入组100例非小细胞肺癌（NSCLC）患者，其中I和II患者占56%，发生远处转移的患者占19%。利用上述研发的基于靶向重测序策略NGS测序技术对其cfDNA进行靶向重测序，研究分析了基因变异图谱、等位基因突变频率、对于存在对治疗有指导意义基因突变图谱、基因突变互斥和共发生、克隆与亚克隆等，并分析了肺癌基因变异规律与临床病例资料以及患者生存期之间的关系，对其诊断可行性进行探索；③建立了基于微滴式数字PCR EGFR突变检测技术：此项技术涵盖目前临床上几乎全部的靶向治疗热点基因突变位点，不仅可用于血浆ctDNA而且也能用于唾液ctDNA的检测。其中EGFR-T790M突变检测技术联合企业进行伴随诊断试剂盒的研发，通过国家药品监督管理局（NMPA）检验，结果显示与国际同类产品相比具有良好的可靠性和准确性；④NSCLC患者血浆与唾液cfDNA-EGFR突变分析：在本研究中我们利用上述研发的检测技术探索唾液cfDNA在定量和定性水平上在非小细胞肺癌中的潜在应用。同时，探讨配对血浆cfDNA和唾液cfDNA中EGFR突变检测的一致性，并分析了EGFR突变与临床治疗疗效的关系。

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