Kif18a基因突变导致卵子成熟障碍的机制研究

Oocyte meiotic arrest is one of the important reasons of women primary infertility，while the mechanism that leads to the arrest of human oocyte maturation is unknown. We found a patient with oocyte maturation arrest and sequenced the exomes of six members of a family using Whole Exome capture and Illumina sequencing technology. Kif18a gene mutation (c.A819G, p.T273A) was identified related to the arrest of oocytes. In the next experiment, we found the oocyte arrest is more serious of Kif18a mutation than gene knock out, which implicated the dominant negative effective. Kif18a gene plays an important role in the oocyte meiosis, when gene is knocked out, the members of kinesin family could play compensatory role, while when Kif18a gene is mutated, the mutated protein could not act normally and at the same time occupied the combination site of interacting protein (PP1) which made the compensatory protein could not act, leading to the oocyte matuation arrest. The project will apply with mouse occytes in vitro culture, microinjection, dot mutation and immunopretipaion to evaluate the mechanism of Kif18a mutation in the occyte meiosis arrest. Once the theory above is confirmed, we can provide an important theoretical supplement to the oocyte meiosis arrest that leads to female primary infertility.

卵子成熟障碍是导致女性原发性不孕的重要原因，但其发病机制至今未明。我们在前期工作中，通过一位卵子成熟障碍患者的家系分析，利用外显子测序方法，发现Kif18a基因突变（c.A819G，p.T273A）与卵子成熟障碍密切相关。进一步实验证实，Kif18a基因突变比基因敲除表现为更为严重的卵子成熟障碍，说明其中可能存在显性负性调控作用机制。据此我们提出假说：Kif18a在卵子成熟中起着重要作用，当基因敲除后，其家族的其他成员可起到一定代偿性作用；而当Kif18a基因发生突变时，不仅不能发挥正常功能，反而占据了作用蛋白（PP1）的结合位点，使代偿性蛋白无法发挥作用，从而导致卵母细胞成熟阻滞。本课题将采用小鼠卵母细胞体外培养、定点突变、显微注射、免疫共沉淀等方法，阐明Kif18a蛋白在卵母细胞成熟中的作用及基因突变后导致卵子成熟阻滞的具体机制，为卵子成熟障碍这一原发不孕疾病的研究提供重要的理论基础。

体外受精-胚胎移植前常规进行控制性的卵巢刺激，其目的是使较多的卵泡生长、成熟。正常情况下，只有成熟的卵母细胞才能完成受精过程。促排卵周期中获得的一批卵子中大约有10-15%不成熟，但也有0.1-1%的患者，反复促排卵后始终无法获得成熟的卵子，我们称之为“卵子成熟障碍”，其机制至今不明。我们在临床工作中，发现一导致卵子成熟障碍的突变基因Kif18a，突变位点为c.A819G，p.T273A。研究通过不同时期小鼠卵母细胞的检测发现，MI期的卵母细胞中，Kif18a基因表达达到高峰，之后表达下降。且Kif18a基因的突变比缺失可以造成更为严重的临床表现，即完全性的卵子成熟障碍。进而构建Kif18a突变基因的稳定转染细胞系，通过蛋白质谱的方法，比较了对照组和突变组细胞中的差异表达蛋白，发现Kif18a基因突变后，PP1蛋白的表达明显上调。通过进一步实验，观察到当Kif18a基因被突变时，PP1蛋白其他驱动蛋白结合情况明显减弱，而当Kif18a表达被抑制时，PP1蛋白仍然能够和其他驱动蛋白进行结合。即Kif18a基因突变后可能存在着一种显性负性调控机制：即当基因敲除后，家族中其他基因往往会产生代偿性的功能；但当基因发生突变时所产生的无功能蛋白，不但不发挥正常功能，还会与代偿性蛋白产生竞争性抑制，从而产生更严重的功能缺陷。项目资助发表SCI论文4篇，国内核心期刊论文2篇。课题在基因水平探讨了卵母细胞成熟障碍这一疾病的发病机制，有助于加深对哺乳动物卵母细胞成熟机制的了解，同时为原发性不孕疾病机理的研究提供重要的理论基础和研究依据。

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