茎瘤固氮根瘤菌趋化受体介导的环二鸟苷酸信号途径及功能研究

Azorhizobium caulinodans ORS571 has the capacity to fix nitrogen not only as a symbiotic bacterium by interacting with Sesbania rostrata, but also as a free-living organism and an associative-symbiotic bacterium by colonizing the root surface of non-leguminous plant. Previously, a PilZ-domain containing chemoreceptor of A. caulinodans ORS571 was identified to bind c-di-GMP and regulate motility and biofilm formation. Genomic analysis of ORS571 has found multiple homologous genes encoding enzymes responsible for c-di-GMP synthesis and hydrolysis, however, the interaction between these enzymes and chemoreceptor and the regulatory mechanism are not clear. In this study, chemoreceptor A3349 is used as bait to screen for target proteins in yeast two-hybrid library. Functions of target proteins are studied by constructing deletion mutations, in vitro protein expression, and enzymatic activity assay. Interactions between proteins are identified by using ITC, pull-down, and co-IP. Responses of target proteins to various environmental factors are studied by using real-time quantitative PCR, western blot, and LC-MS. It is hoped that this study will provide a theoretical framework for the adaptation of ORS571 to environment and the legume-rhizobium interactions.

茎瘤固氮根瘤菌ORS571既可以与毛萼田菁共生固氮，又可以自生或作为内生菌在其他植物体内固氮，其信号转导系统复杂多样。本课题组先期研究发现一个具有PilZ结构域的趋化受体能够结合环二鸟苷酸，调控细胞的运动性与生物膜形成。通过ORS571基因组学分析发现一系列编码环二鸟苷酸合成及降解相关的同源基因，但其如何与趋化受体互作来调控细胞的生理功能尚不清楚。本项目拟以甲基化受体A3349为诱饵蛋白，从酵母双杂交文库中筛选能够与A3349互作的靶标蛋白，通过缺失突变、蛋白体外表达、环二鸟苷酸合成及降解酶活性分析等手段，鉴定各个靶标蛋白的生物学功能；利用等温滴定量热仪、pull-down、免疫共沉淀等手段验证蛋白间的互作；采用实时定量PCR、蛋白质印迹法、液质联用等技术研究靶标蛋白对不同环境因子的响应机制。该项研究将为揭示根瘤菌的适应机制及其与宿主的互作机理提供重要的理论依据。

茎瘤固氮根瘤菌不仅能够与宿主田菁建立共生体系固氮，还能够在自生状态下进行固氮。环二鸟苷酸（c-di-GMP）是细菌中广泛存在的第二信使，能够调控细菌的多种生理功能，包括运动能力，胞外多糖的合成，细菌毒力等。本项目针对茎瘤固氮根瘤菌和宿主田菁共生体系建立的过程中，c-di-GMP信号途径中相关蛋白的功能与调控机制进行了深入研究，主要结果如下：1）利用生物信息学的方法系统分析了茎瘤固氮根瘤菌ORS571基因组中c-di-GMP代谢相关基因，共发现37个编码GGDEF/EAL结构域的基因。2）鉴定了两个磷酸二酯酶：AZC_4658和AZC_0308（Chp1）同时含有GGDEF/EAL结构域，能够降解细胞内的环二鸟苷酸。Chp1还具有PAS调控结构域，通过结合血红素调控 Chp1的活性。与WT相比，缺失突变体胞内c-di-GMP水平提高，胞外多糖和生物膜产量提高，能够抵抗根瘤菌侵染宿主瞬间产生的过氧化氢毒害。突变体对宿主田菁根系的竞争性吸附能力和结瘤能力提高，但是根瘤数和固氮能力没有受到影响。3）解析了一个c-di-GMP受体蛋白AZC_3349（Cbp1）的功能。Cbp1的N端MA结构域表明其可能是甲基化受体蛋白，C端的PilZ结构域可能结合环二鸟苷酸。通过蛋白质热稳定性迁移方法和等温滴定量热法（ITC），证实Cbp1能够通过构象改变结合环二鸟苷酸。将保守氨基酸位点突变，导致Cbp1完全失去结合c-di-GMP的能力。作为趋化受体，Cbp1的缺失导致ORS571趋化能力降低，对宿主田菁的竞争性根系吸附能力降低，并且竞争性结瘤能力也降低。结果表明，c-di-GMP信号通路能够与细菌趋化系统互作，共同影响茎瘤固氮根瘤菌-田菁共生体系的建立。4）阐释了两个二鸟苷酸环化酶（DGC）蛋白AZC_2412和AZC_2512的功能。与WT相比，突变株c-di-GMP含量降低，胞外多糖和生物膜形成能力减弱，细胞的运动和絮凝能力减弱，竞争性根系吸附和结瘤能力降低。5）阐释了一类新型调控蛋白ActR的功能。ActR通过调控细胞内c-di-GMP含量，调控细胞的生理生化状态及与宿主植物互作能力。.项目组初步绘制和解析了固氮根瘤菌环二鸟苷酸信号通路的基本框架图，为阐明细菌与环境及宿主的互作机制提供了重要的理论依据。

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