ChREBP通路调节奶山羊乳腺糖酵解的机制研究

When large quantity of metabolic glucose is supplied to lactating animals, the glycolysis in the mammary gland (MG) is enhanced and lactic acid is largely produced, which finally damages the MG health and reduces the efficiency of milk production. Recently, the glycolysis in the lactating MG has drawn great interest, but the literature is limited on the regulatory mechanisms. The carbohydrate responsive element binding protein (ChREBP) is an important target for the glycolysis in the MG. Thus, it is important to clarify how ChREBP regulates the glycolysis for the MG health and efficiency of milk production. The proposed project is intended to study the effects of glucose on expression of ChREBP and the glycolysis levels, and to investigate the effects of overexpression/silencing of ChREBP on functional network of glycolysis and on metabolites and enzyme activities related with glycolysis in the MG. By conducting the above-mentioned work, our study attempts to reveal the role and mechanism of ChREBP in regulating the MG glycolysis, which will contribute to the nutritional manipulation of the ruminant MG health.

当代谢葡萄糖供给量较大时，动物乳腺糖酵解增强并产生大量乳酸，从而损害乳腺健康并降低乳腺合成能力。目前，泌乳动物乳腺糖酵解的研究越来越受到关注，但其调节机制相关研究较少。碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)是营养素调节动物乳腺糖酵解的重要靶基因，因此明确ChREBP介导的乳腺糖酵解调节机制对维护乳腺健康和改善泌乳效率具有重要意义。本项目拟结合我们前期工作基础，以奶山羊乳腺上皮细胞为模型，研究ChREBP对营养素的动态应答及其对乳腺糖酵解活力的影响，探究过表达或干扰ChREBP对乳腺糖酵解相关信号网络、代谢图谱和酶活的影响。通过这些研究，在细胞水平上揭示ChREBP调节奶山羊乳腺糖酵解的机制，为通过营养手段调控反刍动物乳腺健康提供基础数据。

目前，泌乳动物乳腺糖酵解的研究越来越受到关注，但其调节机制研究较少。碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)是营养素调控动物乳腺糖酵解的重要靶基因，因此明确ChREBP通路调节乳腺糖酵解的机制对改善乳腺健康和泌乳效率具有重要意义。据此，我们开展了三方面工作。首先研究了葡萄糖浓度对乳腺细胞 ChREBP 和糖酵解活力的调节规律，发现与最适水平的葡萄糖相比，低葡萄糖组乳腺细胞中有323个基因显著下降，1670个基因显著上升。进一步比较并确定关键性分子指征物，通过分析DCG和DCL在低葡萄糖 vs. 最适葡萄糖和高葡萄糖 vs. 最适葡萄糖条件下的节点度分布近似符合幂律拟合分布，发现与葡萄糖最适组相比，低糖组乳腺细胞部分 DNB 基因表达上调，这些基因包括 ARG2、 HSPA5、 AMD1、HAPA、ADAMTS1、 KLHL42和 EIF2AK2。与葡萄糖最适组相比，高糖组中表达下调的 DNB 基因包括 FASN、ChREBP和ABCA3。进一步研究了ChREBP 对乳腺糖酵解代谢网络的影响，发现添加葡萄糖后，乳腺细胞中2191个基因的表达量提高，并2039个基因的表达量下调，与此同时，超表达ChREBP组的细胞中396个基因的表达量上升，423个基因的表达量下调，超表达ChREBP的中发生改变的代谢通路，主要有细胞周期、DNA复制、不饱和脂肪酸生物合成；添加葡萄糖所下调的基因，主要参与核糖体代谢、内质网合成和谷胱甘肽代谢等信号通路，不同水平葡萄糖对奶山羊乳腺细胞糖酵解，主要通过AMPK-ChREBP信号介导。因此，我们进一步对ChREBP 下游信号AMPK影响乳腺糖酵解机制解析。我们发现，乳腺氨基酸代谢受到显著影响，其中必需氨基酸（尤其是赖氨酸和蛋氨酸）的代谢受到调节幅度较大；同时，不同乳蛋白分型也随着葡萄糖供给量梯度增加而发生显著改变，这些结果提示，AMPK可能通过乳腺氨基酸代谢利用效率，从而影响乳腺糖酵解水平，通过研究不同葡萄糖供给条件下乳腺AMPK表达关联基因的变化，发现EEF1A1、EEF2、 EIF4EBP1、MTOR、PRKAA1、RPS6KB1六个关键代谢因子也随着葡萄糖供给量不同而发生变化。因此，我们发现提示AMPK-mTOR通过调节乳腺蛋氨酸和赖氨酸的利用效率和方式，对乳腺糖酵解进行调节。

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