欧洲云杉FIE参与体胚萌发过程的调控机制研究

Low germination rate is one of the major problems that limited the application of conifer somatic embryo (SE) propagation in commercial operation. Partial desiccation treatment (PDT) is necessary for proper germination of SE in conifers. In our previous multi-omics studies, a FERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM（FIE）homologous gene，which encodes a highly conserved PcG protein, was found to be involved in the transition from desiccation to germination. In angiosperm, a variety of PcG proteins forms H3K27 methyltransferase complex to participate in chromatin folding and gene expression regulation. Multiple crucial development processes are regulated by this mechanism. FIE is one of the four core proteins in this complex. However, in gymnosperms, PcG proteins are rarely studied. It is unclear yet that if the PcG proteins controlled H3K27 methylation mechanism was conserved in gymnosperm; and what the role of the PcG proteins is in the transition from desiccation to germination. This project plans to clone the Norway spruce FIE and study its expression level during SE germination. To study the function of FIE, RNAi transformation lines will be constructed in Norway spruce. Western blot will be performed to detect H3K27 methylation levels in the RNAi lines and the control. CHIP-seq and RNA-seq will be used to explore the related regulation network. Our work will interpret the role of FIE during the transition from desiccation to germination and lay a foundation for the investigation of the epigenetic regulation mechanism during SE germination in Norway spruce.

体胚萌发率低是制约云杉体胚发生技术大规模应用的关键难点之一，部分干化处理能够促进云杉体胚萌发，课题组前期通过多组学分析发现PcG类蛋白编码基因FIE可能参与相关调控。在被子植物中，FIE作为核心蛋白之一与其他多种PcG类蛋白共同形成H3K27甲基转移酶复合体，控制染色体折叠及基因表达，进而调控众多生命活动。然而，在裸子植物中尚未有关于PcG类蛋白的研究。裸子植物中是否存在类似被子植物的PcG类蛋白调控的H3K27甲基化机制，其具有怎样的功能，目前尚不清楚。本课题拟克隆欧洲云杉FIE基因，研究其在体胚萌发过程中的表达情况；通过遗传转化在欧洲云杉体胚中抑制FIE的表达以研究其功能；通过western blot检验FIE抑制前后的H3K27甲基化水平变化；结合CHIP-seq和RNA-seq研究分析相关调控网络。阐释欧洲云杉FIE在体胚萌发过程中的作用，初步揭示云杉体胚萌发的表观调控机制。

多梳蛋白复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一种由四种核心蛋白构成的高度保守的蛋白质复合体。在动物和植物中，其通过介导H3K27me3的标记直接抑制基因转录，从而在细胞命运决定和细胞分化过程中起关键作用。动物通常只具有一套PRC2蛋白，参与全生命周期的H3K27me标记。然而在高等植物中，PRC2各亚基经历了独立的基因复制和功能分化，不同的PRC2亚基参与不同发育过程。目前仍然缺乏裸子植物PRC2复合体的相关信息。为了开启裸子植物PRC2研究，我们鉴定并克隆了针叶树模式物种欧洲云杉的PRC2蛋白编码基因，包括了全部四种核心蛋白：一个ESC/FIE同系物PaFIE，两个p55/MSI同系物PaMSI1a和PaMSI1b，两个E（z）同系物PaKMT6A2和PaKMT6A4，一个Su（z）12同系物PaEMF2和一个PaEMF2-like片段。系统发育和蛋白质结构域分析表明除单子叶植物外，ESC/FIE在所有高度植物中都是高度保守的。而其他裸子植物PRC2亚基编码基因与被子植物属物种之间都有不同程度的独立进化。我们测定了在不同发育阶段的胚乳和合子和体细胞胚胎中这些基因的相对转录水平。所得结果表明PaMSI1b和PaKMT6A4可能参与胚胎发生，而PaKMT6A2和PaEMF2参与从胚胎到幼苗的转变有关。与PaEMF2-like片段主要在胚乳中表达。此外，使用免疫组织化学测定法检测了欧洲云杉种子发育过程中的H3K27me3模式，H3K27me3标记一般在分生组织区富集。本研究首次报道了针叶松中PRC2核心蛋白基因的特征。我们的工作有助于更深入地了解种子和胚胎发育过程中的细胞重编程过程，并可能指导针叶树胚胎潜力和发育的进一步研究。在项目执行期间，发表了SCI论文2篇，另有1篇论文在投。

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