利用click反应可控制备功能化阳离子凝胶多糖RNAi 纳米载体及其递送siRNA研究

Construction of the novel effective carriers is a key to clinical application of RNAi for remedying critical diseases such as cancer. As the RNAi carriers, the nanoparticles made from cationic amino-curdlan and its functionalized derivatives, were able to deliver siRNA in vitro and vivo efficiently, that could induce RNAi to down-regulate targeted mRNA successfully. However, there are two major problems about such nanocarrier. The one is loading capacity of carriers conflicting with functionalization modification. Another is the contrariety of amination degree to toxicity. Inhere, we want to avoid using amination method to prepare the nanocarriers. In addition, targeting group, stabilizing group, and protecting group would be introduced to carriers in appropriated proportion at a time by click reaction. The nanocarrier of curdlan would be the promising candidate for resolving the contradiction between loading capacity and functionalization, which would also provide some theoretical and practical examples for developing carriers used on the RNAi application.

构建安全高效的RNAi载体是RNAi疗法治疗基因型等重大疾病临床应用的关键之一。前期研究发现：作为RNAi载体，凝胶多糖curdlan及其功能化衍生物的纳米微球，能够有效在体传送siRNA，成功诱导RNAi，显著下调靶标mRNA的表达；然而此类纳米载体存在着功能化修饰与负载能力以及氨基化程度与毒性相矛盾的问题。本项目尝试避开直接氨基化curdlan的方法，拟通过快捷有效的click反应，一次性按比例对curdlan可控引入siRNA的结合功能基团、靶向功能化基团、有效保护及稳定基团，构建优化出新型高效的siRNA靶向纳米载体。本项目所开发的curdlan纳米载体有望克服siRNA负载容量与功能化修饰相矛盾的问题，并为RNAi 临床应用载体的开发提供一些理论依据和实际范例。

RNAi技术被广泛用于探索基因功能和传染病及恶性肿瘤的治疗领域，构建安全高效的递送载体，将siRNA等转入病变器官、组织和细胞，是特异性抑制基因表达的前提，是利用RNAi治疗疾病最为关键的步骤之一。继病毒载体研究之后，有关脂质体、多肽及蛋白质和阳离子型高分子等载体研究取得一定的进展，但大多载体仅限于实验室细胞转染，仅有个别载体能用于临床治疗。安全高效的递送平台的严重匮乏，使RNAi临床推广极度受限。因此，构建安全高效的载体依然是一项十分紧迫且意义深远的研究课题。Curdlan是自然界来源丰富、可生物降解的生物兼容性多糖，已有研究表明氨基化curdlan及其衍生物的纳米微球能够在体递送siRNA和成功诱导RNAi。但直接氨基化curdlan引起的细胞毒性以及进一步功能化受阻是curdlan载体发展的瓶颈问题。为此，本项目利用click反应在curdlan骨架上引入了赖氨酸和鸟氨酸分枝多肽和功能化配体，构建出Cur-6-100Lys、 CTL-PEG-FA和CTOL（5%、10%和20%）系列载体，并体内外综合评价其siRNA/pDNA递送能力、细胞毒性、体内分布以及RNAi效果等。研究发现：在碱性条件下以CuBr为催化剂，通过click成环反应，可实现端缺基分枝多肽与叠氮Curdlan（Cur-N3）的快速组装来制备curdlan类基本载体，一次性引入的多个胺基，在提升载体siRNA/DNA负载量的同时，还充分提供了可进一步修饰功能化的官能团，很好地解决了载体的负载容量和功能化修饰之间的矛盾；赖氨酸嫁接curdlan的纳米载体Cur-6-100Lys，较氨基化curdlan （6AC-100）对DNA负载能力强和细胞转染效果好，且细胞毒性较低；乳糖酸和叶酸靶向配体修饰的载体 CTL-PEG-FA和CTOL，能显著增强HepG2细胞对于载体/siRNA复合物的摄取，且通过RNAi显著下调靶基因表达；对于HCC皮下建模小鼠，CTL-PEG-FA/siRNA复合物主要富集在肿瘤区域，明显抑制肿瘤生长，无明显毒副作用。本项目通过click反应和简单化学修饰，实现了siRNA载体的可控制备及功能化，获得负载量高、递送效率高、靶向性好、安全稳定的新型siRNA载体；解决了curdlan类载体负载容量与功能化修饰相矛盾的问题，为基于天然多糖的RNAi载体开发应用奠定了理论基础。

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