腺病毒CRISPR/Cas9系统介导在体修复OTOF突变 听神经病小鼠耳蜗带状突触功能的研究

Auditory neuropathy (AN) is one type of hearing disorders which has been characterized by abnormal ABR response and poorly language perception. Updated study showed that nearly 42.1% congenital AN children in china are identified to carry OTOF mutations, suggesting that OTOF mutations are the one of key factors associated with AN in Chinese people. Previous study proposed that the deficits in OTOF gene could destroy cochlear ribbon synapse and cause a significant reduction of synaptic neurotransmitter releasing and sound encoding. Although AN subjects with OTOF mutations could benefit from cochlear implant (CI), however, the electrode stimuli could not accomplish a fine and entire sound encoding which are performed physically by IHC ribbon synapses, leading to a defective language perception. Thus, we assume that an intact functional repair of cochlear ribbon synapses will be ideal therapeutic approach for those AN individuals carrying OTOF mutations. Then, in this study, we plan to use mouse model carrying OTOF mutations to mimic the same disorder in human, several molecular components including CRISPER/Cas9 and OTOF donor DNA will be loaded and transducted into inner ear of the mice with AN via an improving adenovirus delivery system in a single operation. We aim to correct OTOF mutations within the cochlear inner hair cells (IHCs) of mice with AN, and to restore transmitter release in cochlear ribbon synapses. Consequently, intact sound encoding and language perception can be achieved successfully. This study could provide additional prospect of gene therapeutic strategy for those congenital individuals with AN, and reveal a clinical value in further.

听神经病 (AN) 主要表现为听力和言语识别能力异常。我国先天性AN患者中，OTOF突变检出率高达41.2%，表明其已是国人先天性AN的重要原因之一。研究证实，OTOF突变听神经病的关键原因为耳蜗带状突触受损。人工耳蜗植入可改善OTOF突变AN儿童听力水平，但电极刺激难以实现内毛细胞突触全部编码功能，导致人工耳蜗植入患儿言语识别和音乐感知能力仍有不足。由此我们推测，在耳蜗内毛细胞中原位纠正OTOF突变可能完全恢复带状突触功能，显著提高患儿言语识别和音乐感知能力。本研究拟采用改进型腺病毒集成投递系统将CRISPR/Cas9、OTOF供体DNA等分子原件共同装载于病毒基因组中，经圆窗膜导入至OTOF突变AN小鼠内耳中，实现一次投递即可纠正小鼠内毛细胞OTOF突变、完全恢复小鼠带状突触声音编码功能的目标。本项目的实施，将为未来先天性AN患者的基因治疗提供新的借鉴，因而具有较高临床价值。

采用基因纠正方法修复或重建遗传性耳聋患者听功能是近10年来听觉研究领域最重要的进展之一。这其中，针对Otof基因致聋的多种基因治疗/纠正的研究尤为引人注目。本项目通过CRISPER/Cas9技术构建了Otof-/-1273 (C>T)小鼠，并对构建小鼠进行了功能验证，我们发现：i) Otof-/-1273 (C>T)小鼠在各频率上均不能引出波形，说明敲除小鼠的听力是完全丧失的; ii)Otof-/-1273 (C>T)小鼠耳蜗基底膜标本进行Otof表达产物的染色标记，发现没有发现otoferlin蛋白，说明小鼠基底膜中otof基因不能表达；iii）采用膜片钳方法检测内毛细胞的胞吐功能，发现小鼠耳蜗内毛细胞的胞吐功能消失；iv）Otof-/-1273 (C>T)小鼠DPOAE功能未受影响；这些结果证明Otof-/-1273 (C>T)小鼠听功能丧失，其主要致病部位在耳蜗内毛细胞带状突触。.之后我们根据gRNA敲除位点构建含同源臂的AAV载体（2000bp左右）， 验证完成之后进行了病毒包装工作（小鼠otof基因高效gRNA AAV8）。 在项目后期，我们进行了包装病毒内耳导入工作。单一AAV病毒内毛细胞转导效率高达100%，由于疫情等客观原因，目前，基因纠正效率的提高和导入小鼠听功能检测工作仍在进行之中。考虑到Cas9系统本身DNA编辑效率因素，在继续进行Cas9系统基因编辑工作同时，我们也同步进行了针对Otof-/-1273 (C>T)的RNA编辑工作。RNA编辑相对于DNA编辑的显著优势是，其不改变基因组DNA的遗传信息，具有更高的安全性。目前，我们正在采用这种RNA编辑技术，优化编辑范围、提高编辑精准度和效率，从而实现高特异性、高效率、高安全性的RNA定点编辑。实现精确靶向细胞和组织的递送，并用于治疗人类遗传疾病。.项目执行以来取得如下重要成果：i) Otof-/-1273 (C>T)小鼠构建及其应用发明专利1项；ii）发表SCI论文13篇，其中IF>5的2篇，中文核心期刊论文5篇；iii)培养博士后4人，博士16人，硕士生9人。实现或显著超过了项目当初的预期目标。

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