唇腭裂相关基因的功能及唇腭裂形成的分子病理

Craniofacial deformities represent a global health issue. The most common of these deformities are clefts of lip and/or primary palate, which occur 1 in 600-700 live births and in most cases, needs surgical repairing at late stages. Cleft lip/palate (CLP) can be found as an isolated feature associated with mild changes in midfacial shape or in association with a wide spectrum of anormalies that define various syndromes. So far, six genes, MID1，PTCH1, PVRL1, MSX1, p63 and IRF6, have been proven to be resposible for syndromatic cleft lip/palate. Recent studies showed that mutations in these six genes were also presented in some isolated cleft lip/palate cases, indicating a common molecular etiology of CLP. Based on previous expression data and functional assay, WNT signaling pathway and its cross-talk with BMP4/SHH signaling has been suggested to play povital role in regulating craniofacial development. Pertubation of this signaling pathways has been indicated in the pathogenesis of CLP via the influences on cell proliferation, apoptosis, cell migration and epithelial-mesenchymal transition in early development. The detailed function of WNT, especially Wnt9b and Wnt3, in reguating craniofacial ectoderm epithelial cell fate and it contribution to CLP is going to be investigated in this study usingtransgenic mice ectopically expressing dominant-negative Wnt9b/Wnt3 in facial ectoderm epithelial. Function of the above six CLP causitive genes and their potential roles in regulating WNT signaling will also be addressed in this study.

唇腭裂大约在每600-700个活产婴中就有一例，目前大多通过外科手术矫正，给患者带来巨大的心理压力并严重影响患者的社会生活。唇腭裂可以单独发生或合并其它器官畸形构成综合征型唇腭裂。目前已报导了六个综合征型唇腭裂的致病基因MID1，PTCH1, PVRL1, MSX1, p63和IRF6，这六个基因的突变也在单纯型唇腭裂病例中被发现，提示各种唇腭裂可能存在共同的分子病理。WNT信号通路可能通过影响细胞增殖，移行和EMT（上皮细胞向间充质细胞的转化）来调控颜面部胚胎发育，本课题拟通过构建过表达条件显性失活突变体（conditional dominant negative）的转基因小鼠，来研究Wnt9b和Wnt3在颜面部早期发育和唇腭裂病理发生中的作用。我们还将初步研究上述6个CLP相关基因的功能，它们对WNT信号通路的影响以及在细胞增殖，移行，凋亡和EMT中的作用，揭示唇腭裂病理发生的分子机制

颜面部的早期胚胎发育依赖于颜面部五大始基的间充质细胞的增殖，移行，以及上皮细胞的融合凋亡和EMT的精细调控，这些过程异常则会导致常见的颜面部先天畸形-唇腭裂。唇腭裂可单独发生（单纯型）或合并其它器官畸形（综合征型）。目前有MID1，PTCH1，PVRL1，MSX1，p63和IRF6的突变在综合征型唇腭裂和单纯型唇腭裂中被报导，被认为是唇腭裂相关基因。本项目着重研究综合征型唇腭裂Opitz综合征的致病基因-MID1及其同源物MID2的分子功能及其细胞内信号通路，研究MID1/MID2基因缺陷对早期颜面部的胚胎发育的影响，并进一步扩展到其它几个唇腭裂相关基因。课题研究结果显示MID1和MID2通过影响细胞内蛋白磷酸酶2A（PP2A）的磷酸化水平，抑制WNT信号通路，在细胞水平促进细胞增殖和凋亡，促进上皮细胞向间充质细胞转化（EMT），抑制细胞移行。而且，MID1和MID2不仅结构上高度同源，功能上也互补。我们应用原位杂交和荧光定量PCR检测发现，在颜面部发育的关键时期（E9.5-E13.5），MID1和MID2在鼠胚颜面部始基的上皮层细胞中均有表达，而且尤以在相互靠近并准备融合的上皮层细胞中高表达，但其表达在颜面部融合后迅速下降。而且荧光定量PCR还揭示MID1和MID2表达分布重叠，但表达水平确存在此消彼长的交互抑制现象，进一步提示MID1和MID2可能存在功能互补（这部分结果已整理成论文发表在上）。在胚胎水平，我们的利用显微注射在早期鸡胚（HH11-13）头部神经管内注入GFP表达质粒，并结合电转将GFP质粒转入一侧神经嵴细胞（neural crest cells），继续培养鸡胚至HH，追踪GFP标记的神经嵴细胞的移行，我们的结果显示胚胎发育早期的神经嵴细胞向胚胎腹侧移行，参与组成颌面部，第一第二咽腮弓和心脏的胚胎组织。由于电转化不适合用于晚期胚胎，我们构建了用于转化晚期鸡胚的表达GFP标记的siRNA的病毒载体RCAS-GFP-siMID1和RCAS-GFP-siMID2，拟用于显微注射转化颜面部发育关键时期（HH27）的鸡胚颌面部，研究基因沉默对颜面部早期胚胎发育的影响。同时，我们还将研究扩展到了其他几个唇腭裂相关基因，初步结果显示IRF6和PVRL1也可以促进细胞增殖和EMT，提示唇腭裂相关基因的可能通过相似的分子信号通路而导致了唇腭裂的病理发生。

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