大头金蝇线粒体基因组的检测分析及其在死亡地点推断中的应用

Flies will reach and lay eggs on the dead bodies within a few minutes, especially the Chrysomya megacephala which belongs to the Calliphoridae is one kind of the indicative insects of the corrupted bodies. Nowadays, due to the increased convenience of transportation, the dead bodies might be migrated，and there might be Chrysoma megacephala from different regions emerging in them. In the past, there had been some reports using the mitochondrial DNA (mtDNA) fragments inferring the species of the forensic insect domestic and overseas, but there rarely had been reports about the use of insect information to inverse where the population origins and where the cases occurs. Based on the preliminary studies of the characteristic mtDNA sequences of sarcosaphagous flies, in this study, Chrysomya megacephala from ten different geographical populations will be collected, their mtDNA will be extracted, amplified, then sequenced and spliced to get the whole mitochondrial genome sequence. After the analysis of these sequences, we will pick out some geographic representative single nucleotide polymorphisms (SNPs) sites, meanwhile analyze the genetic evolution of the geographic populations. After validation, some primers will be designed to establish the molecular marker systems which contain these special SNPs sites. The SNPs molecular genetic markers can help reverse the correct geographic origin of the Chrysomya megacephala, which can also provide the basis for estimating the place of death in the future.

尸体出现数分钟后就有蝇类到达并在其上产卵，尤其是丽蝇科的大头金蝇，是尸体腐败后的指示昆虫之一。由于交通的便利，死后被迁移的尸体上可能会出现携带有来自案发地域的大头金蝇的卵、幼虫或蛹。以往国内外有较多利用线粒体DNA (mtDNA)片段推断法医昆虫物种种类的报道，但很少有利用昆虫资料反推种群来源地、从而推测案发地点的相关报道。本研究拟在前期研究嗜尸性蝇类mtDNA特征序列的基础上，通过提取来自全国十个代表性地域的大头金蝇的mtDNA，扩增、测序并拼接成mtDNA全序列，分析并得到大头金蝇种群的地域性单核苷酸多态性 (SNPs)位点，进行地理种群遗传进化分析。筛选出有代表性的SNPs位点并验证后，设计引物，建立能包含这些位点的分子标记系统，为利用尸体上大头金蝇的分子遗传标记反推其大头金蝇的正确地理来源地奠定基础，为死亡地点(第一案发现场)的推断提供依据。

死亡地点（第一案发现场）的推断是法医侦破案例的难点和重点之一，而地域差异影响遗传差异，遗传差异反应地域特征性。. 对从南向北对分布在我国的10个地区、16个采集点，共64例大头金蝇样本的线粒体DNA全序列进行扩增。大头金蝇各编码区、各种群进行综合分析，包括序列之间的差异、序列编码区之间的差异、地域种群间的差异、种群内部的差异以及地理距离与遗传距离的相关性分析，其中发现：大头金蝇线粒体基因组各编码区进化速率不一致，ND3编码区进化速率最快，COX3编码区单倍型多样性最高，ND4编码区核苷酸多样性最高，ATP8编码区比较保守未发现突变；Mantel检验表明地域种群间相对地理距离越大，遗传距离则越大；其中内蒙古种群与海南种群遗传距离最大，Fst检验提示内蒙古种群有扩张；分子变异AMOVA分析显示绝大多数的遗传分化来自于种群间，通过PCoA聚类分析，不同地域种群大头金蝇分化为3个小的亚种，亚种与亚种之间差异性明显；A亚种在4785和5804位置上突变与未突变产生的两种单倍型与地域分布有关，山东大部分地区与广西桂林、钦州地区为未突变型，河南周口与山西忻州、阳泉、运城为突变型；云南昆明和楚雄地区地域种群的rRNA编码区整体进化趋势在B亚种内要小于其他地域样本，表现为13533、14304、14305、14521、14849位点整体相对无变异；内蒙古两地域样本（包头和赤峰）表现为相对较高的遗传分化程度，特别是B亚种的ND5编码区其分化程度已显著高于周边地区；中国地区样本与NCBI上已知的国外样本经序列比对发现，在两个位点上存在绝对差异（具体专利申请中），可以做为大头金蝇中国地域性标志的SNP检测位点。. 总之，遗传分化与地理相对距离相关性分析获得大头金蝇在所有地域种群间的分化程度、与昆虫亚种结合分析可以归纳出两类与地缘关系密切相关的单倍型分型；而通过能够辨识地理环境差异性的分子标记系统，可以为不同地域种群的区分打下基础，为研究揭示大头金蝇来源地提供基础信息为是否第一案发现场的推断提供理论依据。

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