新型CDF家族蛋白CdffT的晶体结构解析及其结构-功能关系分析

Preliminary experiments showed for the first time that CdffT is a novel CDF family transporter with Na+(Li+, K+)/H+ antiport and Zn2+(Cd2+)/H+ antiport activity. However, due to their ionic size, all identified CDF family transporters can’t accommodate Na+, Li+, K+ in the active sites. Therefore, it’s so intriguing to discover its molecular mechanism that CdffT can extrude monovalent and divalent cations at the same time. In this project, we plan to lay more important stress on the analysis of crystal structure of CdffT through the combination of prokaryotic overexpression of CdffT and X-ray diffusion technique. Also, we plan to analyze the structure-function relationship of CdffT through site-directed mutagenesis of potential functionally important amino acid residues. Taken together, we plan to discover molecular mechanism of monovalent and divalent cation efflux by CdffT. As a novel CDF family transporter, analysis of crystal structure and structure-function relationship of CdffT will be very helpful to not only understand molecular mechanism of extruding monovalent and divalent cations at the same time, but also enhance our knowledge of the key role of CDF family transporters and Na+(Li+)/H+ antiporters in bacterial halo-alkali tolerance.

前期研究中，我们首次发现CdffT是一个同时具有转运单价阳离子（Na+、Li+、K+）和二价阳离子（Zn2+、Cd2+）功能的新型CDF家族蛋白。然而，由于离子半径或者过大或者 过小，已知的CDF家族蛋白的活性中心可能无法容纳Na+、Li+、 K+。因此，揭示其具体如何同时输出单价和二价阳离子的分子机制是值得期待的。本项目拟采用原核过量表达和X衍射技术，对CdffT晶体结构予以解析；同时，通过定点突变方法对CdffT的保守氨基酸残基与其转运功能之间的结构-功能关系进行分析，以确定其中负责转运单价和二价阳离子以及与pH值调控有关的重要残基；最终，综合CdffT的晶体结构及其结构-功能关系，揭示该蛋白同时转运单价和二价阳离子的分子机制。作为新型CDF家族蛋白，本研究的开展不仅可以揭示CdffT转运多种阳离子的分子机制，而且可以增进人们对CDF家族蛋白和钠/氢逆向转运蛋白在细菌耐盐碱方面的认识。

前期研究中，我们发现CdffT是一个同时具有转运单价和二价阳离子功能的新型CDF家族蛋白。然而，由于离子半径或者过大或者过小，已知的CDF家族蛋白的活性中心可能无法容纳Na+等单价阳离子。因此，揭示其具体如何同时转运单价和二价阳离子的分子机制是值得期待的。首先我们明确该蛋白的功能：主要行驶Na+等单价阳离子输出蛋白功能，同时具有Zn2+协助扩散功能，但不具有Zn2+输出功能，并将基因正式定名为mceT（monovalent cation efflux transporter）。我们发现MceT与已知CDF家族蛋白均具有其家族特有的4个关键Motif（Motifs 1-4），且Motif 2和Motif 4差异不大；但Motif1和Motif3表现出显著差异。以往CDF家族蛋白表现为DD(ND, QD)-HD，而MceT则变异为Y44S48-Q50D154。系统发育学分析显示，MceT与已知三大类的CDF家族蛋白（Zn-CDF、Fe/Zn-CDF及Mn-CDF）亲缘关系较远，代表一类新型CDF家族蛋白，命名为Na-CDF。重要的发现是揭示MceT阳离子选择性的一个重要原则：MceT雇佣同一离子转运通道负责以上单价和二价阳离子的转运；其中，Q150、S158 和 D184负责其Na+(Li+, K+)/H+逆向转运活性，而D41、D154和D184负责其Zn2+协助扩散功能。更重要的是揭示MceT进化启示：MceT通过功能相关的关键Motif变异为Y44S48-Q50D154，导致其功能从负责二价阳离子输出转变为主要负责单价阳离子输出。在此基础上，我们进一步明确Site B和Site C尤其是后者所在的CTD对MceT实现Na+外排功能至关重要，但不参与Zn2+协助扩散功能；相比之下，TMD则仅负责Zn2+协助扩散。基于以上结果，我们预测MceT蛋白Na+外排和Zn2+协助扩散的分子机制模型。科学价值在于：首次报道以往CDF家族蛋白不具有的单价阳离子输出功能，并揭示CDF家族蛋白在阳离子选择性和进化方面重要启示。研究成果属于原始创新。

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