肽穿膜参与调控DNA基因表达的研究

许多生物膜活性肽可结合DNA，以转录因子样作用调控基因表达，调节动物生理稳态。这类活性肽发挥作用的效率决定于抵抗肽酶降解、高效进入细胞和细胞核和特异性结合染色体。国内研究已经对活性肽抗酶解和穿膜特性相关结构特点开展了部分研究，关于DNA结合肽的研究大部分集中于非特异性结合，研究对象主要为癌细胞，但对特异性结合DNA的活性肽研究很少，对活性肽结合正常细胞DNA的研究很少开展。Lfcin B是目前已知具有调控正常细胞基因表达的典型特异性DNA结合肽，其结合DNA的机理尚不清楚。本研究拟以Lfcin B为研究母肽，根据抗酶解和膜作用的构效关系，重新进行分子设计，以期得到抗酶解、可透膜的新性染色体结合肽。并分别以癌细胞和正常真核细胞DNA为主要研究靶点探究其结合DNA和调控基因表达的机理。该研究有助于阐明DNA结合肽调节机体生理稳态的机制，也为可发以基因调控为目的的活性肽提供必要的理论依据。

食物蛋白及其水解生成的生物活性肽具有多重作用机制，目前对其胞内作用机制的研究很少。研究表明一些活性肽可以通过以类转录因子样作用参与基因表达调控，调解生理功能。研究有助于阐明肽调节机体生理稳态的机制，为认识活性肽设计提供必要的理论依据。.本课题主要目标是研究活性肽的抗酶解稳定性、可穿膜性和DNA特异性结合后参与调控基因表达作用。基于穿膜肽ppTG20、髓肽MP4，设计了不同特性的两组活性肽。通过研究这些肽穿膜、结合DNA并参与基因表达调控的机制，总结电荷、疏水性等与肽活性之间的关系。基于两条母肽——穿膜肽ppTG20和髓肽MP4，通过替换相关氨基酸残基获得净电荷和疏水性梯度变化而获得两组衍生肽。二级结构、肽活性预测、酶解位点预测和DNA结合位点预测等软件等分析显示设计获得的衍生肽基本符合预期，预示肽和DNA的结合受到净电荷和疏水性变化的影响。通过细菌、细胞实验验证了两组衍生肽具有相应的生物活性。增加ppTG20衍生肽的净电荷使抑菌活性提高，但增加疏水性会使抑菌活性降低。MP4衍生肽在0.1-10μg/mL的低作用浓度下即可表现出对HepG2存活率的影响，降低电荷可以提高抑癌效果，但提高电荷以后表现出促进细胞增殖的效果，提示进行改造设计后肽的作用位点发生了变化，说明肽与DNA的结合可能存在特异性。采用荧光、紫外、圆二色谱和凝胶电泳等研究肽和DNA体外结合机制显示，各肽均能导致DNA的光谱变化和电泳行为变化。增加母肽的净电荷可以增加母肽与DNA磷酸基团结合的活性，疏水性变化对结合的影响受残基的不同而比较复杂。P、L和R残基对DNA结合有积极的影响。细胞定位和肽-膜相互作用实验结果表明，各肽（除P3外）均可在正常作用浓度，不瓦解细胞膜的情况下穿透细胞膜后聚集于细胞内发挥作用。通过磁珠偶联肽对DNA片段的特异性吸附实验，表明ppTG20衍生肽中的P5 通过特异性地结合dnaA和rnhA序列，P7通过特异性地结合rnhA 序列，引起大肠 杆菌 DNA 的损伤并抑制大肠杆菌的DNA复制。同时它们还显著降低DNA复制 和RNA表达。.综上，基于穿膜肽和内源性肽设计的活性肽，可以穿透细胞膜并特异性的结合在DNA上，参与细胞的基因表达调控，从而发挥其生物活性。不同疏水性残基的替换对肽的DNA结合特异性造成影响，肽的DNA结合活性随肽净电荷的提高而上升，调节基因表达。

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