肿瘤细胞线粒体DNA拷贝数异常改变的分子基础研究

线粒体DNA（mtDNA）是细胞内独立于核基因组之外的遗传物质，在人体生理及病理过程中发挥重要功能。本项目组及其他小组的研究结果表明：在多种肿瘤细胞中，mtDNA拷贝数呈现异常升高或降低。大量研究也证实mtDNA拷贝数异常与肿瘤发生及进展密切相关。然而，导致肿瘤中mtDNA拷贝数异常改变的分子机制至今尚不十分清楚。本项目组基于以往在肿瘤和mtDNA方面的研究基础和丰富经验，拟以mtDNA拷贝数显著升高的大肠癌及显著降低的肝癌作为代表性研究对象，基于临床标本及细胞模型，利用实时定量PCR方法检测mtDNA拷贝数，应用第二代高通量测序技术评估mtDNA的序列变异，借助免疫染色等形态学方法观察线粒体类核结构及线粒体自噬的变化，并通过免疫组织化学、实时定量PCR、DNA测序等手段分析mtDNA拷贝数调控关键分子在基因及蛋白水平的改变，进而系统性探讨肿瘤细胞中导致mtDNA拷贝数异常改变的分子基础。

线粒体DNA（mtDNA）是细胞内独立于核基因组之外的遗传物质，在人体生理及病理过程中发挥重要功能。大量研究证实mtDNA拷贝数异常与肿瘤发生及进展密切相关。然而，导致肿瘤中mtDNA拷贝数异常改变的分子机制至今尚不十分清楚。.项目组圆满完成项目预期目标，并取得如下研究成果：1)建立系统规范的肝癌及大肠癌生物样本资源库；2）建立系统全面的mtDNA序列检测技术平台；3)发明一种全新的双barcode二代测序文库构建方法，有效减少甚至消除基因捕获过程中样本间的交叉污染问题；4) 发现基因捕获（capture）方法富集线粒体DNA相比于基于PCR技术富集的mtDNA测序后覆盖深度分布更加均一，解决线粒体DNA富集方法覆盖不均一的问题；5)完成200例肝癌组织和100例大肠癌mtDNA的全基因测序及分析；6)完成大肠癌及肝癌细胞株的mtDNA全基因组测序；7）完成近300例外周血淋巴细胞mtDNA拷贝数与肝癌发病及预后相关性分析；8）完成近600例外周血淋巴细胞mtDNA拷贝数与大肠癌发病及预后相关性分析；9）完成近300例大肠癌组织mtDNA拷贝数调控关键分子的筛选分析及相关性分析；10）完成大肠癌组织mtDNA拷贝数调控关键分子的预后分析；11)建立大肠癌mtDNA拷贝数调控关键分子POLG的细胞模型并进行mtDNA特定复制调控关键分子表达的调控作用分析；11)完成近200例肝癌组织mtDNA拷贝数调控关键分子的筛选分析；12）建立肝癌mtDNA拷贝数调控关键分子TFAM的细胞模型并进行机制研究；13）发现并阐明CD147分子抑制mtDNA拷贝数的作用机制：①利用锌指核酸酶技术成功构建了CD147基因敲除的肝癌细胞；②利用新一代测序技术对CD147分子敲除的肝癌细胞系转录组进行深度测序发现：CD147敲除后线粒体氧化呼吸链复合体部分基因表达显著上调；③CD147分子可通过激活PI3K/Akt信号通路促进MDM2分子的磷酸化，进而导致mtDNA复制关键调控基因p53分子的降解，促使其下游mtDNA复制基因PGC1a、TFAM、SOC2的表达降低，最终下调了mtDNA在肝癌细胞中的拷贝数及线粒体发生；14）发现Drp1蛋白可以通过调控线粒体融合分裂影响肝癌细胞mtDNA拷贝数,Drp1过表达可显著促进线粒体融合进而促进肝癌细胞mtDNA拷贝数生成增加和肝癌转移。

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