一种基于分子内交联的PEG化尿酸氧化酶及其免疫原性的研究

Hyperuricemia is a kind of frequently-occurring disease that is seriously harmful to human health. Hyperuricemia usually leads to repeated seizure of arthritis and renal lesions. Urate oxidase (UOX) can effectively decrease the uric acid level of the patients. However, UOX suffers from the disadvantages of high immunogenicity and short half-life. Conjugation of polyethylene glycol (PEG) with UOX can solve these problems. However, the PEGylated UOX suffers from easy induction of anti-PEG antibody and low bioactivity retention，which limit its clinical application..The present project proposes a molecular mechanism, i.e., the production of anti-PEG antibody is related to the tetramer dissociation of UOX. This mechanism is demonstrated by biopharmaceutical, immunological and biophysical studies . Based on this mechanism, 4-arm PEG is used to intra-molecularly crosslink UOX, which can prevent the tetrameric dissociation of UOX and avoid the exposure of its interior antigenic epitopes. Afterwards, small amount of low molecular weight PEG without the methoxy group is used to modify the crosslinked UOX. The immunogenicity of the PEGylated UOX can be decreased by lowering the number and type of the antigenic epitopes of PEG. The bioactivity retention of the PEGylated UOX can be improved by decreasing the steric shielding effect of PEG on the bioactive domain of UOX. By studying the in vivo stability and biosafety of the PEGylated UOX, the long-acting mechanism and the druggability of the PEGylated UOX are determined.

高尿酸血症是一种严重危害人类健康的多发病，可导致关节炎和肾病变的反复发作。尿酸氧化酶（UOX）能有效降低患者体内的尿酸水平，但存在着免疫原性强和半衰期短等缺点。聚乙二醇（PEG）修饰UOX可解决这些问题。然而，PEG化UOX易诱导产生抗PEG抗体，而且活性保持率低，影响了其临床应用。.本项目提出了一种分子机制，即抗PEG抗体的产生与UOX四聚体的解聚存在关联。通过生物药剂学、免疫学和生物物理学的研究可证明这一机制。在此基础上，使用四臂PEG制备分子内交联的UOX，可阻止UOX四聚体的解聚，避免暴露其内部的抗原表位；使用少量低分子量且不带甲氧基的PEG继续修饰交联的UOX，减少PEG抗原表位的种类和数量，从而降低其免疫原性；通过减少PEG对UOX活性中心的屏蔽作用，提高PEG化UOX的活性保持率。通过研究PEG化UOX在体内的稳定性和生物安全性，确定其在动物体内的长效机制和成药性。

高尿酸血症是一种严重危害人类健康的多发病，可导致关节炎和肾病变的反复发作。尿酸氧化酶（UOX）能有效降低患者体内的尿酸水平，但存在着免疫原性强和半衰期短等缺点。聚乙二醇（PEG）修饰UOX可解决上述缺点。然而，PEG化UOX易诱导产生抗PEG抗体，而且活性保持率低，影响了其临床应用。. 本项目提出了一种分子机制，即抗PEG抗体的产生与UOX四聚体的解聚存在关联。首先，制备具有不同解离常数的PEG化UOX，评价其免疫原性和抗原性，测定与抗UOX多克隆抗体的结合能力，通过上述研究验证该分子机制。在此基础上，使用小分子试剂双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯（DBBF）和四臂PEG分别对UOX进行分子内交联，然后再进行PEG修饰，得到了候选药物UOX-DBBF-PEG和4arm-PEG-UOX，评价了它们的体外活性、热稳定性、pH稳定性和酶解能力，同时研究了它们的免疫原性、药代动力学和药效动力学以及对脏器的毒副作用。. 结果表明，抗PEG抗体的产生与UOX四聚体的解聚存在关联。PEG化UOX的解离常数越低，产生的抗PEG和抗UOX抗体滴度也相应越低；基于分子内交联的候选药物UOX-DBBF-PEG和4arm-PEG-UOX，保持了约82%的活性，循环半衰期分别提高13倍和10倍左右，免疫原性降低了2.5倍和1倍左右；显著提高了UOX的热稳定性、pH稳定性和抗酶解能力；毒副作用比原酶UOX显著降低。并且效果明显优于直接用PEG修饰UOX得到的产物。. 本项目探讨了PEG化UOX存在免疫原性较高等问题的可能机理，对研究PEG化蛋白质药物具有一定的指导意义；得到了两种UOX的候选药物，对开发治疗高尿酸血症的长效药物提供一种有效研究策略，具有一定的临床应用价值。

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