链格孢真菌新颖fusicoccane二聚体及其对线虫PolyQ神经毒性保护的研究

Previous work showed that novel dimers of fusicoccane isolated from Alternaria brassicae bearing an unprecedented 5/8/5 - 5/9/5 or 5/8/5 - 5/8/5fused carbocyclic skeleton rings connected by C12-C18', and secondary metabolites demonstrated different protective effects against neurocytotoxicity in cultured PC12 and BV-2 cells and could significantly improve learning and memory dysfunction in AD mice. Therefore, this project will aim to the enlarge fermentation by OSMAC strategy, enrichment and analysis by HPLC-MS-MS, isolation using modern chromatographic separation methods and identification by spectroscopic techniques. Their activities will be evaluated by nematode endogenous polyQ aggregation inhibitory effects, the change in behavior trend and lifespan assay in Caenorhabditis elegans. Furthermore, the components’ neuroprotective mechanism will be elucidated by DAF-16 nuclear localization and oxidative stress assay in C. elegans. This subject will further clarify the neuroprotective components for the development in the field of neurological diseases of natural products resources.

前期工作显示芸薹生链格孢发酵的次生代谢产物具有神经保护作用，并分离得到5/8/5环与5/9/5（5/8/5）环系以C12-C18’相连的壳梭菌素新颖二聚体，药理实验证明其对诱导损伤的PC12及BV-2神经细胞具有保护作用，并能显著改善AD小鼠学习记忆功能障碍。故本项目锁定链格孢壳梭菌素类型化学体系，采用OSMAC策略，放大发酵并定向富集和分析成分，运用现代色谱学的分离手段和波谱学鉴定技术，快速精准分离和鉴定化合物结构。并应用神经系统疾病药物筛选的理想模型-秀丽线虫，构建PolyQ介导的HA759线虫的ASH神经元损伤模型，从线虫内源性PolyQ 聚集抑制作用、体外趋化行为学和延长寿命三个方面评价化合物对神经元衰退的缓解作用，得到针对调控DAF-16/FOXO 通路上机制明确的新颖先导化合物，丰富链格孢的神经保护药效物质基础，也为天然产物在神经退行性疾病药物领域的开发利利用提供新型研发模型。

链格孢属真菌链格孢（Alternaria alternata）广泛分布于自然界，对环境和寄主具有较强的适应性。前期工作显示芸薹生链格孢发酵的次生代谢产物具有神经保护作用。基于前期工作，本课题对来源于贯叶连翘的链格孢进行大米固体培养，放大发酵并定向富集分析成分。采用正相硅胶柱、反相硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱和高效液相色谱等分离方法，运用IR、UV、HRESIMS、一维和二维1H-NMR、13C-NMR等波谱技术，结合ECD计算和分析，X-单晶衍射及其各种化学方法确定了化合物的绝对构型，对链格孢次生代谢产物进行了分离鉴定。从链格孢发酵产物中共分离并鉴定出34个化合物，包括21个聚酮类，4个甾体类，1个二倍半萜类，1个苝醌类和7个其他类。化合物1为新化合物，采用系统命名法将其命名为3- hydroxy-1-(3-hydroxy-5-methoxyphenyl)-2- methylpropan-1-one。对分离得到的化合物采用LPS诱导的BV-2小胶质细胞模型验证活性，发现1和14能降低NO和炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平，具有抗神经炎症活性。选定5个与炎症反应相关的靶点蛋白作为受体，包括iNOS、JNK、NF-dB p65、Caspase-1和p38，根据对靶蛋白和化合物的对接情况，推测化合物1和14可能是通过NF-db. p65和p38信号通路发挥抗神经炎症作用。除了抗神经炎症活性，还筛选了细胞毒和抗菌活性。细胞毒性实验表明，化合物 7、8、9对所测试的5株细胞系（RKO、A549、HepG2、SU-DHL-2和HL-60）具有一定的细胞毒性；抗菌活性实验表明，化合物25、28、31和32对金黄色葡萄球菌具有不同程度的抑制活性；化合物25和26分别对猪丹毒杆菌和猪链球菌具有一定的抑制活性。该项目的研究为链格孢在神经系统的应用提供了理论依据，筛选了部分活性化合物的抗菌和细胞毒活性。与该项目相关的研究共发表论文8篇（第一资助标注），培养硕士生2名，申请专利2项，并对链格孢在中国典型培养物保藏中心进行了保藏。

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